磁珠-寡核苷酸微陣列多重可擴(kuò)增探針雜交技術(shù)的建立及在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)是一種有嚴(yán)重危害的X染色體隱性遺傳病，在各類(lèi)遺傳病中，杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是發(fā)病率最高的疾病之一。DMD患者為男性，女性為攜帶者。男孩在2歲左右發(fā)病，癥狀嚴(yán)重，多于20歲之前死于呼吸衰竭，循環(huán)衰竭。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們正在積極努力地尋求治療此病的方法。但是，到目前還沒(méi)有任何方法可以徹底治愈該病。因此，對(duì)杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥進(jìn)行準(zhǔn)確，全面的癥前診斷及產(chǎn)前診斷，防止患兒出生是針對(duì)此病最重要的措施

2、。建立一種快速，準(zhǔn)確，全面的檢測(cè)方法是診斷該病的迫切要求。 方法：應(yīng)用了一種基因缺失檢測(cè)的新技術(shù)—多重可擴(kuò)增探針雜交技術(shù)(MAPH)檢測(cè)了5例正常對(duì)照和5例臨床已診斷為DMD缺失的樣品。該方法針對(duì)進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良基因79個(gè)外顯子中的52個(gè)外顯子進(jìn)行缺失的檢測(cè)，根據(jù)進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良基因cDNA相關(guān)序列，對(duì)該52個(gè)外顯子設(shè)計(jì)了特異性引物和芯片上寡核苷酸探針。用特異性引物經(jīng)PCR分別擴(kuò)增出各外顯子序列，并進(jìn)行克隆，使各外顯子序列前后都

3、帶有相同的載體序列。用通用引物擴(kuò)增出的具有通用引物序列的PCR產(chǎn)物作為可擴(kuò)增探針組，與固定在磁珠上待測(cè)的基因組DNA雜交，并用磁珠回收特異性雜交的探針，回收的探針經(jīng)擴(kuò)增及熒光標(biāo)記后，與相應(yīng)的寡核苷酸芯片雜交，數(shù)據(jù)分析，以達(dá)到檢測(cè)DMD外顯子缺失的目的。本試驗(yàn)以磁珠替代了傳統(tǒng)MAPH技術(shù)中應(yīng)用的尼龍膜，磁珠是一種進(jìn)行雜交反應(yīng)的載體，其上帶有被酶切的DNA片段，在其適宜的雜交緩沖液下，與所要檢測(cè)的各外顯子的探針雜交，當(dāng)待檢者DNA片段與某段

4、探針完全匹配時(shí)，此探針則結(jié)合到磁珠上去，若待檢者DNA上dystrophin基因有缺失，則相應(yīng)缺失部位的探針不能與磁珠結(jié)合，經(jīng)磁珠緩沖液的清洗，只有結(jié)合到磁珠上的探針才能被回收。傳統(tǒng)MAPH方法中，由于尼龍膜面積小(2mm×3mm)，在多次轉(zhuǎn)移，清洗過(guò)程中，尼龍膜上DNA或探針易受損并且易受污染，影響檢測(cè)結(jié)果。與尼龍膜相比，磁珠有操作簡(jiǎn)便，回收探針效率高等優(yōu)點(diǎn)。 傳統(tǒng)的MAPH方法在探針組回收后經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，通過(guò)電泳技術(shù)檢測(cè)

5、雜交回收的探針，仍存在檢測(cè)通量的限制。應(yīng)用寡核苷酸芯片來(lái)檢測(cè)雜交回收的探針，寡核苷酸芯片的主要原理是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，以檢測(cè)對(duì)應(yīng)片段是否存在、存在量的多少，該方法可使檢測(cè)通量極大的提高，結(jié)果也更直觀(guān)，應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)芯片進(jìn)行定量分析，結(jié)果更加精確。 結(jié)論：磁珠—寡核苷酸微陣列多重可擴(kuò)增探針雜交技術(shù)應(yīng)用磁珠代替尼龍膜進(jìn)行MAPH方法的檢測(cè)更加簡(jiǎn)便，應(yīng)用基因芯片作為檢測(cè)工具使結(jié)果更加直觀(guān)，也便于將各熒光信號(hào)應(yīng)用分析軟件

6、進(jìn)行分析，有效減少了人為判斷誤差。尼龍膜與探針雜交后，探針的回收一直是整個(gè)MAPH方法的關(guān)鍵問(wèn)題，在傳統(tǒng)的MAPH方法中探針的回收率很低，用磁珠代替尼龍膜雜交后，其探針回收率較高，使整個(gè)試驗(yàn)的成功率大大提高。目前對(duì)進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良大部分外顯子缺失的檢測(cè)在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用MAPH檢測(cè)技術(shù)結(jié)合磁珠及寡核苷酸芯片技術(shù)檢測(cè)DMD患者外顯子缺失可達(dá)52個(gè)，在國(guó)內(nèi)尚數(shù)首次。結(jié)果證明磁珠—寡核苷酸微陣列多重可擴(kuò)增探針雜交方法是一種檢測(cè)通量高，