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文檔簡(jiǎn)介
1、遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良?。⊿pondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT,MIM 313400)是一種X連鎖隱性遺傳病,主要累及脊椎椎體和承重大關(guān)節(jié)。其主要臨床特征為:患者骨骼病變,?;脊顷P(guān)節(jié)炎,身高增長(zhǎng)下降致短軀干性侏儒。
SEDL基因的突變導(dǎo)致SEDT的發(fā)生(MIM 300202)。該基因定位于Xp22,全長(zhǎng)20 kb,包含6個(gè)外顯子。SEDL基因的表達(dá)產(chǎn)物為140個(gè)氨基酸組成的Sedl
2、in蛋白,而且該蛋白高度保守,在人類和酵母具有相同的氨基酸序列。Sedlin蛋白是酵母TRAPP(transport protein particle)復(fù)合物中Trs20p亞基的同源物。目前認(rèn)為TRAPPⅠ定位于高爾基復(fù)合體的順面,為COPⅡ膜泡的受體,在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復(fù)合體的膜泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用;TRAPPⅡ則主要作用于高爾基復(fù)合體內(nèi)部的物質(zhì)運(yùn)輸。酵母中Trs20p亞基是 TRAPPⅠ、TRAPPⅡ所共有的,而且Trs20p亞基的失活
3、具有致死效應(yīng),因此推測(cè)Sedlin蛋白質(zhì)可能在物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基復(fù)合體之間的膜泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用。
為了了解哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Sedlin蛋白的功能,本課題組成員已經(jīng)利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到了若干Sedlin蛋白的結(jié)合蛋白,其中包括一些已知蛋白,如胞內(nèi)氯離子通道蛋白(chloride intracellular channel,CLIC),EB病毒誘導(dǎo)的基因3(Epstein-Barr virus-induced ge
4、ne 3,EBI3)蛋白,MRG相關(guān)的蛋白PAM14(protein associated with MRG,14 kD),它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)均具有廣泛的功能。
先前已利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段證實(shí)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Sedlin蛋白與CLIC1是相互作用的,提示Sedlin蛋白可能在細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
本研究是在上述研究的基礎(chǔ)上,探尋Sedlin蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)與PAM14蛋白是否存在相互作用,以進(jìn)一
5、步了解Sedlin蛋白的功能。首先構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCDGFP-SEDL、pCDGFP-PAM14,轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光方法,檢測(cè)Sedlin蛋白、PAM14蛋白單獨(dú)表達(dá)時(shí)在細(xì)胞內(nèi)的定位情況;轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blot鑒定蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-3X-SEDL以表達(dá)融合蛋白GST-Sedlin,進(jìn)行GST-pull down 實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Sedlin蛋白在體外
6、與PAM14蛋白能否相互作用;進(jìn)行免疫共沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Sedlin蛋白與PAM14蛋白能否相互作用,能否共定位,共轉(zhuǎn)染對(duì)蛋白質(zhì)的定位有無(wú)影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Sedlin蛋白為一分子量約16kD的蛋白質(zhì),在胞質(zhì)和胞核中均有分布,且主要表達(dá)于胞核;GFP-PAM14融合蛋白的分子量約為41kD,主要表達(dá)于細(xì)胞核,細(xì)胞質(zhì)較少。GST-pull down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,融合蛋白GST-Sedlin與PA
7、M14蛋白之間存在相互作用;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),Sedlin蛋白與PAM14蛋白之間存在相互作用;免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明Sedlin蛋白與PAM14蛋白在細(xì)胞核存在共定位,且改變不同的蛋白標(biāo)簽,對(duì)共定位結(jié)果沒(méi)有影響。綜上,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),Sedlin蛋白與PAM14蛋白之間存在相互作用。
PAM14,是由127個(gè)氨基酸殘基組成的14 kD的高度保守的蛋白質(zhì)。因其與MRG15(mortality facto
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