PAM14與Sedlin相互作用的進(jìn)一步研究.pdf

1、目的:運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)研究Sedlin蛋白與PAM14蛋白的相互作用區(qū)域;構(gòu)建PAM14蛋白及PAM14蛋白N端C端缺失突變體和Sedlin蛋白的真核表達(dá)載體,共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,分別觀察在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的共定位情況;構(gòu)建帶HA標(biāo)簽的PAM14-N蛋白與帶GFP標(biāo)簽的Sedlin蛋白共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,進(jìn)行免疫共沉淀,檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Depp蛋白與Sedlin蛋白能否相互作用。構(gòu)建Sedlin蛋白點(diǎn)突變體S30A,V

2、130D到pcDGFP真核載體中轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中觀察單轉(zhuǎn)定位情況與野生型的差別,分別再與帶HA標(biāo)簽的PAM14缺失突變體蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞觀察共定位情況。
　　方法:以含人PAM14全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒pACT2-PAM14為模板,用PCR方法擴(kuò)增PAM14的cDNA序列,用限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物,回收目的片段,連接到酵母系統(tǒng)3提供的載體pGBKT7上,構(gòu)建表達(dá)載體pGBKT7-PAM14。用相似的方法構(gòu)建酵母系

3、統(tǒng)載體pGBKT7-PAM14-N和pGBKT7-PAM14-C,真核表達(dá)載體 pCDNA3.1-PAM14-N-HA和 pCDNA3.1-HA-PAM14-C(N端254bp,編碼84個(gè)AA,標(biāo)記為PAM14-N)。
　　把構(gòu)建的酵母表達(dá)載體分組轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài),檢測(cè)它們相互作用的情況。pGADT7-Sedlin/pGBKT7,pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14 pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM1

4、4-N,pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-C pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-N-N,pGADT7-Sedlin/pGBKT7-PAM14-N-C pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(S30A) pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(V130D) pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(F83L) pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedli

5、n(S73L)
　　pGADT7-PAM14/pGBKT7-Sedlin(D47Y)把測(cè)序正確的酵母表達(dá)載體分組轉(zhuǎn)化至酵母菌 AH109,在 SD/-Leu/-Trp/-His/+3-AT/X-α-gal盤(pán)上篩選藍(lán)色的克隆。呈藍(lán)色的克隆是α-gal活性為陽(yáng)性的克隆。
　　將構(gòu)建正確的質(zhì)粒pCDNA3.1-PAM14-N-HA/pCDGFP-Sedlin和pCDNA3.1–HA- PAM14/pCDGFP-Sedlin(S30

6、A)分別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,制作免疫熒光片,在熒光顯微鏡下觀察它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位。根據(jù)熒光片觀察的結(jié)果分析,初步判斷它們共定位于細(xì)胞核。將pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDGFP-Sedlin共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞,提取細(xì)胞裂解液,進(jìn)行免疫共沉淀,后通過(guò)Western blot檢測(cè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)PAM14-N蛋白與Sedlin蛋白能否結(jié)合。
　　結(jié)果:經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,各組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。營(yíng)養(yǎng)篩選及α-半乳糖苷酶活

7、性的測(cè)定均表明PAM14-N和Sedlin能相互作用;pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDGFP-Sedlin轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,免疫熒光顯微鏡觀察PAM14-N和Sedlin共定位于細(xì)胞核區(qū)域;pCDNA3.1-HA-PAM14和pCDGFP-Sedlin(S30A)轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中,免疫熒光顯微鏡觀察PAM14和Sedlin(S30A)共定位于細(xì)胞核區(qū)域;免疫共沉淀還有待證明PAM14-N蛋白和Sedlin蛋白在HE