異檸檬酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能研究及MRG15和PAM14相互作用方式的研究.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(IDH)是一大類酶家族，該酶催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，在生物的能量產(chǎn)生和生物合成代謝中起著非常重要的作用。真核生物中以NADP為輔酶的異檸檬酸脫氫酶(NADP-IDH)具有很多重要的生物功能，但其動(dòng)力學(xué)機(jī)制和活性調(diào)節(jié)機(jī)理目前還不清楚。我們以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為研究手段，結(jié)合生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法來(lái)研究人源細(xì)胞質(zhì)NADP-IDH(HclDH)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制和活性調(diào)節(jié)機(jī)理。已得到該酶不同形式(野生型和突變體)及其相關(guān)復(fù)

2、合物的蛋白質(zhì)晶體，通過(guò)分析已有的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了氨基酸點(diǎn)突變。Ser<'94>對(duì)應(yīng)于EclDH上發(fā)生可逆磷酸化調(diào)節(jié)酶活性的位點(diǎn)Ser<'113>，而Asp<'279>可以在沒(méi)有底物的條件下與Ser<'94>形成氫鍵。對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)我們?cè)O(shè)計(jì)完成了四個(gè)突變體，分別為S94A、S94D、D279A和D279N，它們對(duì)異檸檬酸和Mn<'2+>的K<,m>值都明顯增大，而對(duì)NADP的Km值幾乎沒(méi)有變化，其表現(xiàn)出的酶活性大大降低。同時(shí)，我們對(duì)影響NADP

3、結(jié)合的重要位點(diǎn)Arg<'314>和His<'315>進(jìn)行了突變。除了R314K，其他的突變體都表現(xiàn)出對(duì)NADP的K<,m>值的變化，增大為野生型的25倍到90倍不等，而對(duì)異檸檬酸和Mn<'2+>的K<,m>值沒(méi)有明顯變化。這些結(jié)果表明Ser<'94>、Asp<'279>、Arg<'314>和His<'315>在酶催化反應(yīng)中都發(fā)揮著重要的作用，但起作用的方式又不盡相同，分別參與底物和輔酶的結(jié)合。通過(guò)分析結(jié)構(gòu)和酶學(xué)數(shù)據(jù)，我們提出HcIDH采

4、用穩(wěn)態(tài)隨機(jī)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制。我們的研究結(jié)果為闡明異檸檬酸脫氫酶的催化機(jī)制提供了依據(jù)，并幫助我們分析理解該酶的生物學(xué)功能。 MRG15是組織中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在很多真核生物中都存在其同源物，它們共同組成了MRG蛋白家族。MRG15在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞衰老過(guò)程中起重要作用。其羧基端獨(dú)立形成一個(gè)保守的MRG結(jié)構(gòu)域，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控中與Rb蛋白和另一核蛋白PAMl4的相互作用。在已有MRG結(jié)構(gòu)域(MRG15C)晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)

5、上，我們采用酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)研究MRG15上MRG結(jié)構(gòu)域(MRG15C)與PAM14的相互作用方式，基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變來(lái)尋找與PAM14結(jié)合中起作用的重要氨基酸位點(diǎn)。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，我們將PAM14截成三段(PAM14N、PAM14M和PAM14C)，發(fā)現(xiàn)PAM14N與MRG15C的相互作用最強(qiáng)。隨后我們進(jìn)行了MRG15C單點(diǎn)突變和雙突變體與。PAM14N的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步闡明MRG15和PAM14的相互作用方