GSH2基因沉默對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的作用.pdf

1、胰腺癌是致死率最高的腫瘤之一，五年生存率小于5％。美國(guó)在過(guò)去的5年內(nèi)，因胰腺癌每年死亡的人數(shù)超過(guò)30000人。傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)、放療、化療等，療效均有限。胰腺癌的早期預(yù)防、診斷、治療十分重要，亟待對(duì)其發(fā)病及進(jìn)展原因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究。
　　GS homeobox2(GSH2)基因，同時(shí)也稱作GSX2基因，是同源盒基因家族的一員，定位于染色體4q12，由304個(gè)氨基酸組成。GSH2基因是同源盒基因家族的一員，調(diào)控細(xì)胞的

2、增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等功能。在胚胎神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成中，GSH2協(xié)同SHH信號(hào)通路參與上述過(guò)程說(shuō)明兩者聯(lián)系密切相關(guān)，SHH通路在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而GSH2在胰腺癌中的作用未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌組織中GSH2基因的表達(dá)情況。通過(guò)RNA干擾技術(shù)靶向沉默GSH2基因，檢測(cè)對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等功能，吉西他濱敏感性及HH信號(hào)通路通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響。通過(guò)Co-IP技

3、術(shù)檢測(cè)在SW1990細(xì)胞中GSH2同SHH及GLI1的相互作用。
　　第一部分 GSH2基因在胰腺癌組織中的表達(dá)
　　目的:檢測(cè)胰腺癌組織中GSH2基因的表達(dá)情況。
　　方法:收集胰腺癌組織及癌旁正常組織各3例，通過(guò)HE染色、免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)GSH2的表達(dá)情況。以癌旁正常組織為對(duì)照，用RT-PCR法檢測(cè)GSH2基因在mRNA水平表達(dá)的差異，蛋白印跡法檢測(cè)GSH2基因在蛋白水平表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:本部分實(shí)

4、驗(yàn)中免疫組化顯示GSH2在癌組織中表達(dá)明顯強(qiáng)于癌旁正常組織，主要表達(dá)在胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞核部位。RT-PCR結(jié)果顯示癌組織中GSH2的相對(duì)表達(dá)量:8.40±0.32，癌旁組織GSH2相對(duì)表達(dá)量:0.95±0.04，提示胰腺癌癌組織中GSH2的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組高(t=23.27，p＜0.001)。蛋白印跡法結(jié)果提示胰腺癌癌組織中GSH2的蛋白表達(dá)量較對(duì)照組高。
　　結(jié)論:GSH2基因在胰腺癌組織中高表達(dá)。
　　第二部分

5、 沉默GSH2對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號(hào)通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響
　　目的:沉默GSH2對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號(hào)通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響。
　　方法:用siRNA技術(shù)靶向沉默胰腺癌SW1990細(xì)胞的GSH2基因后，以轉(zhuǎn)染NC-siRNA的細(xì)胞做對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞增殖（CCK-8法）、遷移（Transwell法）、侵襲（Invas

6、ion Chamber法）能力變化。并聯(lián)合吉西他濱處理，檢測(cè)處理后細(xì)胞增殖及凋亡（流式細(xì)胞儀）的變化。構(gòu)建靶向沉默GSH2基因的shRNA載體質(zhì)粒，并篩選沉默效果最佳者。用siRNA及shRNA沉默GSH2基因，分別以轉(zhuǎn)染NC-siRNA及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞做對(duì)照。通過(guò)RT-PCR及蛋白印跡法檢測(cè)GSH2基因在mRNA及蛋白水平的沉默效率，并檢測(cè)HH信號(hào)通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1在mRNA及蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:沉默GSH

7、2基因后，細(xì)胞在450nm的吸光值為2.89±0.02，低于對(duì)照組（3.39±0.02;t=20.74，p＜0.001）;遷移透膜細(xì)胞數(shù)為157.2±6.71，低于對(duì)照組（349.3±8.33;t=17.95，p＜0.001）侵襲透膜細(xì)胞數(shù)63.21±1.16，低于對(duì)照組（95.71±3.51;t=8.79，p＜0.001）。聯(lián)合吉西他濱處理后，細(xì)胞在450nm的吸光值為2.48±0.02，低于對(duì)照組（2.89±0.02;t=17.24

8、，p＜0.001）;細(xì)胞凋亡百分為39.70％±0.52％，高于對(duì)照組（26.38％±1.17％;t=10.39，p＜0.001）。成功構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒并篩選出沉默效果最佳者。siRNA有效沉默GSH2后，RT-PCR檢測(cè)GLI1、SHH mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.01、1.07±0.05，與對(duì)照組相比，Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（1.00±0.05;t=16.69，p＜0.001）而SHH mRNA表達(dá)量變

9、化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.00±0.02;t=1.13，p=0.32）;WB結(jié)果顯示Gli1蛋白表達(dá)明顯減少，而SHH蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。重組質(zhì)粒GSH2-shRNA有效沉默GSH2后，RT-PCR檢測(cè)GLI1、SHH mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.18±0.004、0.97±0.07，與對(duì)照組相比Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（0.98±0.03; t=25.72，p＜0.001）而SHH mRNA表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.00±0.

10、02;t=0.42，p=0.70）;WB結(jié)果顯示Gli1蛋白表達(dá)明顯減少，而SHH蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)染GSH2-siRNA可降低胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，可增加對(duì)吉西他濱的敏感度。轉(zhuǎn)染GSH2-siRNA與GSH2-shRNA均可減少HH信號(hào)通路關(guān)鍵分子GLI1的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　第三部分 胰腺癌SW1990細(xì)胞中GSH2與HH信號(hào)通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的聯(lián)系
　

11、　目的:檢測(cè)在胰腺癌SW1990細(xì)胞中GSH2與HH信號(hào)通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的聯(lián)系。
　　方法:獲取SW1990細(xì)胞的蛋白裂解液，采用Crosslink Magnetic Co-IP試劑盒，獲取SHH及GLI1的磁珠沉淀蛋白（pulldown蛋白），并以兔IgG為陰性對(duì)照，無(wú)處理的蛋白裂解液為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)pulldown蛋白中GSH2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:陽(yáng)性對(duì)照中檢測(cè)出GSH2、SHH、GLI1蛋

12、白。陰性對(duì)照未檢測(cè)到蛋白。SHH磁珠沉淀蛋白中檢測(cè)到SHH、GSH2蛋白。GLI1磁珠沉淀蛋白中檢測(cè)到GLI1、GSH2蛋白。
　　結(jié)論:胰腺癌SW1990細(xì)胞中GSH2與SHH及GLI1存在蛋白間的相互作用。
　　第四部分 GSH2-siRNA裸鼠皮下瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　目的:檢測(cè)GSH2-siRNA對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤增殖及吉西他濱敏感性的影響
　　方法:將siRNA處理48小時(shí)后的SW199

13、0細(xì)胞種植于裸鼠右前肢背部皮下，每只接種1×107/100ul細(xì)胞懸液，將裸鼠隨機(jī)分成A組:NC-siRNA;B組:GSH2-siRNA;C組:NC-siRNA+吉西他濱;D組:GSH2-siRNA+吉西他濱。兩周后開始腹腔注射吉西他濱(100mg/kg)，每3天注射一次，連續(xù)腹腔注射2周后處死裸鼠，取出皮下瘤，記錄腫瘤體積，并觀察腹腔及胸腔轉(zhuǎn)移灶情況。
　　結(jié)果:所有裸鼠在兩周后均可成瘤，處死后腹腔及胸腔均未見轉(zhuǎn)移灶。NC-si

14、RNA組與GSH2-siRNA組的腫瘤體積無(wú)顯著差異（260.1±61.25、216.6±26.64，t=0.59，p=0.572）。聯(lián)合吉西他濱處理后，GSH2-siRNA組的腫瘤體積為74.4±16.19，小于NC-siRNA組（100.5±23.36,t=3.16,p=0.016）。
　　結(jié)論:在裸鼠皮下瘤中，沉默GSH2基因可增加胰腺癌SW1990細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。
　　通過(guò)上述研究，本課題得出結(jié)論如下: