溶癌腺病毒ZD55-IL24殺傷舌鱗癌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的舌癌是最常見的口腔腫瘤。迄今為止，治療上主要依靠外科手術(shù)和放療，但并未明顯提高患者的生存率。從腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)出發(fā)研究新的治療方法是舌癌治療研究的重要方向。腫瘤的生物基因治療是目前研究的熱點(diǎn)，有學(xué)者應(yīng)用反義RNA、自殺基因、免疫調(diào)節(jié)基因等進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。在基因治療中導(dǎo)入系統(tǒng)的發(fā)展是極其重要的，目前主要包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體由于轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢(shì)，目前應(yīng)用較為廣泛，其中包括轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等。腺病

2、毒載體由于具備不整合入染色體、容易制備等特點(diǎn)，在基因?qū)敕矫婢哂歇?dú)特的優(yōu)勢(shì)。由于前兩代腺病毒載體外源基因表達(dá)時(shí)間短等缺陷，尋找新型的腺病毒載體是現(xiàn)在發(fā)展的方向，其中溶癌腺病毒就是一種第三代的腺病毒載體。 溶癌腺病毒是通過對(duì)腺病毒的基因改造使其復(fù)制具有腫瘤特異性，而對(duì)正常細(xì)胞幾無影響；在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制后可裂解腫瘤細(xì)胞，并釋放出子代病毒，感染周圍腫瘤細(xì)胞，直至完全殺滅腫瘤。國外應(yīng)用溶癌腺病毒治療腫瘤取得一定進(jìn)展，但臨床試驗(yàn)表明溶癌腺

3、病毒并未達(dá)到理想的抗腫瘤效應(yīng)。因此，有必要對(duì)這種溶癌腺病毒進(jìn)一步改造，使其攜帶抗癌基因，增強(qiáng)其抗癌作用。 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建攜帶IL-24的溶癌腺病毒載體ZD55，觀察其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113的轉(zhuǎn)染效果、體外作用并且探討其可能的機(jī)制。 方法1、利用攜帶有能表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒載體ZD55-GFP(Greenfluorescentprotein)，體外轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113，在熒光顯微鏡和相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染

4、效果。 2、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)GFP的表達(dá)量。 3、Westernblot檢測(cè)舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113的CAR(thecoxsackie-adenovirusreceptor)的表達(dá)。 4、應(yīng)用MTT法，檢測(cè)ZD55-IL24對(duì)舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113增殖的影響。 5、應(yīng)用結(jié)晶紫染色，檢測(cè)ZD55-IL24對(duì)舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113的細(xì)胞毒性作用。同時(shí)還檢測(cè)了對(duì)正常人肺成纖維細(xì)胞(normalh

5、umanlungfibroblasts,NHLF)的毒性作用。 6、Westernblot檢測(cè)ZD55-IL24轉(zhuǎn)染后舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113的caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果熒光顯微鏡結(jié)果顯示，不同感染復(fù)數(shù)(MultiplicityofInfection，MOI)的ZD55-GFP轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞株48小時(shí)后，能夠表現(xiàn)不同強(qiáng)度的熒光。隨著感染復(fù)數(shù)的提高，熒光強(qiáng)度相應(yīng)增強(qiáng)。相差顯微鏡結(jié)果顯示，感染后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生

6、了明顯改變。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，隨著感染復(fù)數(shù)的增加，熒光蛋白的表達(dá)量也相應(yīng)提高。 通過Westernblot檢測(cè)Tca8113的CAR的表達(dá)狀況，相比于白血病細(xì)胞株K562、Kassumi，舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113具有較明顯的CAR表達(dá)。采用MTT比色法檢測(cè)ZD55-IL24對(duì)Tca8113的增殖影響。結(jié)果顯示，不同感染復(fù)數(shù)(0、1、10、100MOI)的ZD55-IL24處理Tca8113細(xì)胞株5天后，具有明顯的抑制作用

7、，且表現(xiàn)為劑量依賴性。相同感染復(fù)數(shù)(100MOI)的ZD55-IL24處理Tca8113細(xì)胞3、5、7天后，結(jié)果顯示，對(duì)Tca8113具有明顯的抑制作用，且表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。 通過結(jié)晶紫染色法觀察了ZD55-IL24、ZD55-GFP、Ad-IL24對(duì)Tca8113細(xì)胞株、NHLF(nonnalhumanlungfibroblasts)的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果顯示，處理5天后，相比空白對(duì)照組ZD55-IL24、ZD55-GFP對(duì)Tc

8、a8113有明顯的殺傷作用，Ad-IL24效果不明顯；且在相同感染復(fù)數(shù)時(shí)，ZD55-IL24作用的Tca8113細(xì)胞存活數(shù)比ZD55-GFP作用的少。而ZD55-IL24、ZD55-GFP、Ad-IL24處理NHLF5天后，結(jié)果顯示，相比空白對(duì)照組，并無明顯的細(xì)胞毒性作用。通過Westernblot技術(shù)在蛋白水平檢測(cè)100MOIZD55-IL24作用Tca8113細(xì)胞0、12、24、48h,可見caspase-3發(fā)生明顯的剪切，且隨著作

9、用時(shí)間的延長，剪切越明顯。 結(jié)論1、溶癌腺病毒ZD55能在體外成功轉(zhuǎn)染人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞，且具有較高的轉(zhuǎn)染效率。 2、溶癌腺病毒ZD55-IL24對(duì)Tca8113細(xì)胞的具有明顯的生長抑制作用，且具有時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囮P(guān)系。 3、溶癌腺病毒ZD55對(duì)正常人肺成纖維細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性作用。4、溶癌腺病毒ZD55-IL24對(duì)Tca8113細(xì)胞生長抑制作用通過誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。 5、ZD55載體