新型溶癌腺病毒SG511-BECN對(duì)白血病細(xì)胞殺傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的K562細(xì)胞株，以此作為研究對(duì)象來證實(shí)自噬現(xiàn)象的發(fā)生及被抑制的過程，并進(jìn)一步探討溶癌腺病毒誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬發(fā)生的潛在機(jī)制。⑵探討SG511-BECN抗白血病效應(yīng)，通過體外試驗(yàn)證實(shí)SG511-BECN可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，而對(duì)正常細(xì)胞幾無影響。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其潛在作用機(jī)制。從而為白血病治療提供更具靶向性的基因-病毒療法。
　　 方法：①運(yùn)用電轉(zhuǎn)染的方法將PEGFP.LC3質(zhì)粒

2、轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞株中，并通過有限稀釋法使其穩(wěn)定表達(dá)，從而建立可穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的K562細(xì)胞株。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定GFP的表達(dá)率來反映LC3的轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用雷帕霉素——國(guó)際公認(rèn)的可誘導(dǎo)自噬的mTOR抑制劑處理轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察綠色點(diǎn)狀熒光即LC3- II的產(chǎn)生與否來直接反映LC3是否成功轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞株中。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SG511對(duì)各種白血病細(xì)胞株的感染效率。通過熒光顯微鏡觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(L

3、C3)的表達(dá)來檢測(cè)其可否誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬，并進(jìn)一步通過western blot免疫印跡法檢測(cè)LC3表達(dá)水平的變化。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞中Beclin-1的定位關(guān)系。應(yīng)用小干擾技術(shù)通過western blot、熒光顯微鏡檢測(cè)耐紫外線相關(guān)基因表達(dá)蛋白(UVRAG)表達(dá)水平的改變來探討SG511-BECN誘導(dǎo)自噬發(fā)生的潛在機(jī)制，并進(jìn)一步通過MTT法檢測(cè)UVRAG-siRNA處理后的白血病細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。熒光顯微鏡觀察活性氧物質(zhì)ROS的

4、表達(dá)變化檢測(cè)SG511-BECN誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞自噬發(fā)生過程中ROS所發(fā)揮的作用。MTT法測(cè)定SG511-BECN對(duì)K562的細(xì)胞毒性及對(duì)正常外周血單個(gè)核細(xì)胞的毒性。MTT法測(cè)定使用ROS抑制劑Trion處理白血病細(xì)胞后，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　 結(jié)果：⑴運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到可高表達(dá)GFP的單克隆LC3-K562細(xì)胞株，GFP表達(dá)率為73.6％。⑵通過熒光顯微鏡可觀察到雷帕霉素處理過的LC3-K562細(xì)胞胞漿中有明顯的綠色點(diǎn)狀熒

5、光產(chǎn)生。說明已成功構(gòu)建LC3-K562細(xì)胞株，并且雷帕霉素可誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞自噬。⑶體外試驗(yàn)中SG511可有效感染白血病細(xì)胞株。⑷SG511-BECN可有效誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株LC3-K562自噬并伴隨LC3-II的表達(dá)，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)自噬現(xiàn)象逐漸減低。⑸當(dāng)SG511-BECN感染細(xì)胞后定位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。⑹用UVRAG- siRNA處理SG511-BECN作用過的LC3-K562細(xì)胞株后，綠色自噬熒光明顯減少，并且MTT結(jié)果顯示白血病

6、細(xì)胞得到保護(hù)，SG511-BECN對(duì)其的細(xì)胞毒作用明顯減弱。說明UVRAG是SG511-BECN誘導(dǎo)自噬不可或缺的物質(zhì)。⑺對(duì)比之下SG511-BECN對(duì)正常外周血單個(gè)核細(xì)胞的毒性殺傷效應(yīng)較小，具有靶向殺傷腫瘤的效應(yīng)。⑻使用ROS抑制劑TRION處理白血病細(xì)胞株K562后，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況明顯逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：SG511-BECN可有效感染白血病細(xì)胞株，并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562發(fā)生自噬性死亡，而對(duì)正常外周血單個(gè)核細(xì)胞的殺傷