經(jīng)體外環(huán)路光動力療法對白血病細胞的殺傷作用及機制研究.pdf

1、本課題組嘗試將Hyp干預(yù)后的大鼠血液導(dǎo)出體外，引流入玻片夾層，形成薄層血流，施與高強度的光照，以探索經(jīng)體外血流環(huán)路Hyp-PDT對大鼠外周血白細胞的影響，并觀察Hyp-PDT對血液中其他細胞及機體是否造成損傷;同時觀察Hyp-PDT對體外培養(yǎng)的人白血病細胞株K562的殺傷作用并深入探索其相關(guān)機制和作用通路;最后，我們通過薄層玻片系統(tǒng)模擬白血病大鼠的體外血流環(huán)路對U937細胞和K562細胞實施Hyp-PDT，以驗證通過體外環(huán)路對白血病細胞

2、實施Hyp-PDT的可行性，希望增加新的白血病治療策略，從而改善白血病患者的健康。
　　第一部分經(jīng)體外血流環(huán)路Hyp-PDT治療對大鼠正常白細胞的殺傷作用及對其它血細胞的影響
　　目的:初步探索經(jīng)體外血流環(huán)路Hyp-PDT對大鼠正常白細胞的影響及其可能的副作用，確認體外循環(huán)下實施Hyp-PDT的有效性。
　　方法:所有實驗動物隨機分為4組:Sham組（假手術(shù)組），EBL組（體外環(huán)路組），EBL+Hyp組（體外循環(huán)+金絲

3、桃素無光照組），EBL+Hyp-PDT組（體外循環(huán)+金絲桃素介導(dǎo)的光動力學(xué)治療組），每組5只。通過頸總動脈與股靜脈插管并連接薄層玻片系統(tǒng)建立體外血流環(huán)路以構(gòu)建體外循環(huán)SD大鼠模型。EBL+Hyp-PDT組腹腔注射金絲桃素3 mg/kg，給藥后4h行插管手術(shù)，術(shù)后1.5h連接體外環(huán)路進行1h光照（595 nm波長）實施Hyp-PDT; EBL+Hyp組進行1h的體外循環(huán)但無光照，其余同EBL+Hyp-PDT組;EBL組手術(shù)前4h腹腔注射等

4、量DMSO生理鹽水，術(shù)后1.5 h連接體外環(huán)路進行1h的體外循環(huán);Sham組同時間點腹腔注射等量DMSO生理鹽水溶液，僅進行插管手術(shù)，但不連接體外血流環(huán)路。所有體外循環(huán)大鼠分別于給藥前(T1)、手術(shù)前即給藥后4h(T2)、手術(shù)后0.5h(T3)、光照前即手術(shù)后1.5h(T4)、光照后1.5h(T5)、光照后3h(T6)經(jīng)尾尖或頸總動脈采血測血常規(guī)，Sham組也于相應(yīng)時間點進行檢測;分別于給藥前和光照后3h或相對應(yīng)時間點測腎功能;于給藥前

5、、光照前和光照后3h采血做血涂片;并于給藥前、給藥后3h、給藥后6h、給藥后9h收集中性粒細胞，熒光顯微鏡觀察細胞對金絲桃素的攝取情況。
　　結(jié)果:1）給藥后3h血液中白細胞可見微弱熒光，注射后6h和9h均可見大量白細胞有強烈的橘紅色熒光。2）血常規(guī)結(jié)果顯示，各組術(shù)后均可見白細胞顯著性升高并于1h回落至術(shù)前水平，但同時間點各組間無顯著性差異。EBL+Hyp-PDT組的白細胞計數(shù)于光照后1.5 h及光照后3h持續(xù)下降（均P＜0.05

6、），較給藥前分別下降約30％及47％;而與各對照組光照后同時間點相比，該組白細胞亦顯著下降（均P＜0.05）。血涂片顯示光照后白細胞數(shù)量減少，高倍下可見變形破損的白細胞，但紅細胞和血小板形態(tài)計數(shù)無顯著改變。3）與給藥前相比，各組紅細胞計數(shù)在手術(shù)后有所下降（均P＜0.05），但各組內(nèi)光照或體外循環(huán)前后及各組間同時間點相比并無顯著性差異。除Sham組外，各組血小板計數(shù)在手術(shù)后有所下降（均P＜0.05），但各組內(nèi)光照或體外循環(huán)前后及各組間同時

7、間點相比并無顯著性差異。4）各組大鼠不同時間點血肌酐和尿素氮無顯著差異，組間同時間點相比亦無差別。
　　結(jié)論:1）腹腔注射3mg/kg金絲桃素DMSO生理鹽水溶液不會導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)溶血反應(yīng)，給藥后6小時大鼠血液白細胞對金絲桃素攝取良好，并可持續(xù)一段時間。2）以金絲桃素作為光敏劑，通過體外血流環(huán)路用595nmLED燈照射1h，可有效殺傷大鼠血中白細胞，但對紅細胞和血小板并無顯著損傷。3）通過本課題組設(shè)計的薄層玻片系統(tǒng)進行1h的體外循環(huán)

8、后，大鼠腎功能無顯著損傷。
　　第二部分Hyp-PDT對體外培養(yǎng)的人白血病細胞株K562的殺傷作用
　　目的:觀察Hyp-PDT對體外培養(yǎng)的人白血病細胞株K562的殺傷作用并尋求Hyp-PDT作用的最佳條件，同時探索自噬和凋亡在其中的作用。
　　方法:體外培養(yǎng)人白血病細胞株K562，探索不同光強度(0.1，0.3和0.5mW/cm2)、不同濃度金絲桃素(0，0.2，0.4，和0.8μg/ml)及不同光照時間(0，2，4

9、，和8 min)下實施Hyp-PDT對細胞的殺傷作用，CCK-8測定體外細胞活性變化并比較。確定Hyp-PDT的最適實驗條件后，分別于光照前即刻、光照后4h、8h、16h收集細胞蛋白，免疫印跡實驗測定凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達的變化;光鏡和電鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:1）與DMSO組及金絲桃素無光照組相比，0.4μg/ml金絲桃素孵育后，以0.3和0.5 mW/cm2的光強度照射可顯著降低所有時間點的細胞活性（均P＜0.01。

10、然而，加入同等濃度的金絲桃素后以0.1 mW/cm2的光強度進行照射僅見光照后細胞活性輕微下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。2）Hyp-PDT對K562細胞的殺傷作用呈現(xiàn)金絲桃素濃度和光照時間依賴性;而0.8μg/ml的金絲桃素孵育后光照8分鐘可使細胞活性最低降至5％。但是0.2μg/ml的金絲桃素濃度下進行光動力療法似乎對K562殺傷作用不大，僅在8min光照組出現(xiàn)顯著性下降。3）光鏡下可見光照后出現(xiàn)大量凋亡細胞，胞體皺縮，邊緣模糊，折光性顯著下

11、降，亦有部分細胞壞死。4）透射電鏡顯示Hyp-PDT處理后h即可見凋亡小體的出現(xiàn)，光照后16h凋亡加重。K562細胞光照前即可見自噬體;光照后8小時，DMSO組中的自噬小體數(shù)量有所增多，但金絲桃素組自噬性改變顯著減少，自噬小體幾不可見。5)WB結(jié)果顯示光照后，金絲桃素組cleavedcaspase-3，cleaved caspase-9表達增多，但DMSO組光照前后無變化;光照后8h和16h，用藥組LC3蛋白表達減少，而DMSO對照組則

12、略有升高;用藥組的Beclin-1于光照后16h出現(xiàn)下調(diào)，同時間點可觀察到p-Akt蛋白表達的減少。
　　結(jié)論:1）Hyp-PDT對K562細胞具備有效的殺傷作用，且該作用呈光強度、金絲桃素濃度和光照時間依賴性;2）金絲桃素（濃度0.4μg/ml）孵育5h后，以595nm波長LED燈（光強度為0.3 mW/cm2）照射4分鐘為K562細胞Hyp-PDT的最佳實施方案。3）實施Hyp-PDT后，電鏡下觀察凋亡增加，凋亡相關(guān)蛋白Cas

13、pase-3、Caspase-9活性上調(diào)，說明Hyp-PDT可通過Caspase途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。4）LC3、Beclin-1蛋白表達下調(diào)，電鏡下觀察到自噬體顯著減少，表明Hyp-PDT可通過抑制K562自噬促進細胞死亡，該作用可能與Akt通路的抑制有關(guān)。5）Hyp-PDT可能通過抑制K562細胞的自噬，增加細胞凋亡率，起到殺傷腫瘤細胞的作用。
　　第三部分Hyp-PDT影響體外培養(yǎng)的人白血病細胞株K562凋亡與自噬的MAPK通路

14、機制
　　目的:進一步深入探索p38MAPK、ERK、JNK等通路在Hyp-PDT對白血病細胞K562凋亡和自噬改變中的作用
　　方法:分別于光照前即刻、光照后4h、8h、16h收集細胞蛋白，檢測ERK、JNK、P38等通路蛋白表達。
　　結(jié)果:金絲桃素組光照后4h即出現(xiàn)p-ERK的表達，且其活性隨著時間而增加，而DMSO組并無ERK的激活。p-JNK的表達在Hyp-PDT后顯著增加，于光照后4h表達最強，p-P38的

15、表達在Hyp-PDT后亦有顯著增加。而總ERK、總JNK和P38表達較光照前無顯著。
　　結(jié)論:1）Hyp-PDT后ERK、JNK、P38三條通路的磷酸化表達均增加，但總ERK、總JNK、總P38水平并無改變，認為Hyp-PDT對以上通路的調(diào)節(jié)主要通過增加其磷酸化程度，但并不上調(diào)其基因水平。2）Hyp-PDT可通過促進ERK、JNK、P38三條通路的磷酸化表達，誘導(dǎo)K562細胞凋亡。3）Hyp-PDT對K562自噬的抑制可能與ER

16、K、JNK、P38三條通路的磷酸化增加有關(guān)，其具體關(guān)系尚需進一步研究。
　　第四部分Hyp-PDT通過薄層玻片循環(huán)對人白血病細胞株K562和U937的殺傷作用
　　目的:使白血病細胞模擬體外血流環(huán)路進行循環(huán)，探索其作用條件并驗證Hyp-PDT對其的有效殺傷性
　　方法:體外培養(yǎng)白血病細胞K562和U937，加入濃度為0.4μg/ml的金絲桃素孵育5h后，參照第一部分中大鼠在體實驗時的血液流速(9μl/s)，使細胞懸液在

17、微泵的作用下勻速通過薄層玻片系統(tǒng)，同時實施Hyp-PDT(光照波長為596 nm，白血病細胞經(jīng)過外循環(huán)系統(tǒng)照射時間為15秒左右，光強度設(shè)定為1mW/cm2)。CCK-8法測定細胞存活率，相差顯微鏡觀察Hyp-PDT前后K562和U937細胞形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:1）CCK8顯示光照后K562細胞和U937細胞損傷嚴重，與光照前相比，其細胞活性分別下降了92.65％及98.27％。2）顯微鏡下可見Hyp-PDT后K562和U937