經(jīng)體外環(huán)路光動(dòng)力療法對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、本課題組嘗試將Hyp干預(yù)后的大鼠血液導(dǎo)出體外，引流入玻片夾層，形成薄層血流，施與高強(qiáng)度的光照，以探索經(jīng)體外血流環(huán)路Hyp-PDT對(duì)大鼠外周血白細(xì)胞的影響，并觀察Hyp-PDT對(duì)血液中其他細(xì)胞及機(jī)體是否造成損傷;同時(shí)觀察Hyp-PDT對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞株K562的殺傷作用并深入探索其相關(guān)機(jī)制和作用通路;最后，我們通過(guò)薄層玻片系統(tǒng)模擬白血病大鼠的體外血流環(huán)路對(duì)U937細(xì)胞和K562細(xì)胞實(shí)施Hyp-PDT，以驗(yàn)證通過(guò)體外環(huán)路對(duì)白血病細(xì)胞

2、實(shí)施Hyp-PDT的可行性，希望增加新的白血病治療策略，從而改善白血病患者的健康。
　　第一部分經(jīng)體外血流環(huán)路Hyp-PDT治療對(duì)大鼠正常白細(xì)胞的殺傷作用及對(duì)其它血細(xì)胞的影響
　　目的:初步探索經(jīng)體外血流環(huán)路Hyp-PDT對(duì)大鼠正常白細(xì)胞的影響及其可能的副作用，確認(rèn)體外循環(huán)下實(shí)施Hyp-PDT的有效性。
　　方法:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組:Sham組（假手術(shù)組），EBL組（體外環(huán)路組），EBL+Hyp組（體外循環(huán)+金絲

3、桃素?zé)o光照組），EBL+Hyp-PDT組（體外循環(huán)+金絲桃素介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)治療組），每組5只。通過(guò)頸總動(dòng)脈與股靜脈插管并連接薄層玻片系統(tǒng)建立體外血流環(huán)路以構(gòu)建體外循環(huán)SD大鼠模型。EBL+Hyp-PDT組腹腔注射金絲桃素3 mg/kg，給藥后4h行插管手術(shù)，術(shù)后1.5h連接體外環(huán)路進(jìn)行1h光照（595 nm波長(zhǎng)）實(shí)施Hyp-PDT; EBL+Hyp組進(jìn)行1h的體外循環(huán)但無(wú)光照，其余同EBL+Hyp-PDT組;EBL組手術(shù)前4h腹腔注射等

4、量DMSO生理鹽水，術(shù)后1.5 h連接體外環(huán)路進(jìn)行1h的體外循環(huán);Sham組同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量DMSO生理鹽水溶液，僅進(jìn)行插管手術(shù)，但不連接體外血流環(huán)路。所有體外循環(huán)大鼠分別于給藥前(T1)、手術(shù)前即給藥后4h(T2)、手術(shù)后0.5h(T3)、光照前即手術(shù)后1.5h(T4)、光照后1.5h(T5)、光照后3h(T6)經(jīng)尾尖或頸總動(dòng)脈采血測(cè)血常規(guī)，Sham組也于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè);分別于給藥前和光照后3h或相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測(cè)腎功能;于給藥前

5、、光照前和光照后3h采血做血涂片;并于給藥前、給藥后3h、給藥后6h、給藥后9h收集中性粒細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)金絲桃素的攝取情況。
　　結(jié)果:1）給藥后3h血液中白細(xì)胞可見微弱熒光，注射后6h和9h均可見大量白細(xì)胞有強(qiáng)烈的橘紅色熒光。2）血常規(guī)結(jié)果顯示，各組術(shù)后均可見白細(xì)胞顯著性升高并于1h回落至術(shù)前水平，但同時(shí)間點(diǎn)各組間無(wú)顯著性差異。EBL+Hyp-PDT組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)于光照后1.5 h及光照后3h持續(xù)下降（均P＜0.05

6、），較給藥前分別下降約30％及47％;而與各對(duì)照組光照后同時(shí)間點(diǎn)相比，該組白細(xì)胞亦顯著下降（均P＜0.05）。血涂片顯示光照后白細(xì)胞數(shù)量減少，高倍下可見變形破損的白細(xì)胞，但紅細(xì)胞和血小板形態(tài)計(jì)數(shù)無(wú)顯著改變。3）與給藥前相比，各組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)在手術(shù)后有所下降（均P＜0.05），但各組內(nèi)光照或體外循環(huán)前后及各組間同時(shí)間點(diǎn)相比并無(wú)顯著性差異。除Sham組外，各組血小板計(jì)數(shù)在手術(shù)后有所下降（均P＜0.05），但各組內(nèi)光照或體外循環(huán)前后及各組間同時(shí)

7、間點(diǎn)相比并無(wú)顯著性差異。4）各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血肌酐和尿素氮無(wú)顯著差異，組間同時(shí)間點(diǎn)相比亦無(wú)差別。
　　結(jié)論:1）腹腔注射3mg/kg金絲桃素DMSO生理鹽水溶液不會(huì)導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)溶血反應(yīng)，給藥后6小時(shí)大鼠血液白細(xì)胞對(duì)金絲桃素?cái)z取良好，并可持續(xù)一段時(shí)間。2）以金絲桃素作為光敏劑，通過(guò)體外血流環(huán)路用595nmLED燈照射1h，可有效殺傷大鼠血中白細(xì)胞，但對(duì)紅細(xì)胞和血小板并無(wú)顯著損傷。3）通過(guò)本課題組設(shè)計(jì)的薄層玻片系統(tǒng)進(jìn)行1h的體外循環(huán)

8、后，大鼠腎功能無(wú)顯著損傷。
　　第二部分Hyp-PDT對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞株K562的殺傷作用
　　目的:觀察Hyp-PDT對(duì)體外培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞株K562的殺傷作用并尋求Hyp-PDT作用的最佳條件，同時(shí)探索自噬和凋亡在其中的作用。
　　方法:體外培養(yǎng)人白血病細(xì)胞株K562，探索不同光強(qiáng)度(0.1，0.3和0.5mW/cm2)、不同濃度金絲桃素(0，0.2，0.4，和0.8μg/ml)及不同光照時(shí)間(0，2，4

9、，和8 min)下實(shí)施Hyp-PDT對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，CCK-8測(cè)定體外細(xì)胞活性變化并比較。確定Hyp-PDT的最適實(shí)驗(yàn)條件后，分別于光照前即刻、光照后4h、8h、16h收集細(xì)胞蛋白，免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;光鏡和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:1）與DMSO組及金絲桃素?zé)o光照組相比，0.4μg/ml金絲桃素孵育后，以0.3和0.5 mW/cm2的光強(qiáng)度照射可顯著降低所有時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性（均P＜0.01。

10、然而，加入同等濃度的金絲桃素后以0.1 mW/cm2的光強(qiáng)度進(jìn)行照射僅見光照后細(xì)胞活性輕微下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2）Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用呈現(xiàn)金絲桃素濃度和光照時(shí)間依賴性;而0.8μg/ml的金絲桃素孵育后光照8分鐘可使細(xì)胞活性最低降至5％。但是0.2μg/ml的金絲桃素濃度下進(jìn)行光動(dòng)力療法似乎對(duì)K562殺傷作用不大，僅在8min光照組出現(xiàn)顯著性下降。3）光鏡下可見光照后出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，胞體皺縮，邊緣模糊，折光性顯著下

11、降，亦有部分細(xì)胞壞死。4）透射電鏡顯示Hyp-PDT處理后h即可見凋亡小體的出現(xiàn)，光照后16h凋亡加重。K562細(xì)胞光照前即可見自噬體;光照后8小時(shí)，DMSO組中的自噬小體數(shù)量有所增多，但金絲桃素組自噬性改變顯著減少，自噬小體幾不可見。5)WB結(jié)果顯示光照后，金絲桃素組cleavedcaspase-3，cleaved caspase-9表達(dá)增多，但DMSO組光照前后無(wú)變化;光照后8h和16h，用藥組LC3蛋白表達(dá)減少，而DMSO對(duì)照組則

12、略有升高;用藥組的Beclin-1于光照后16h出現(xiàn)下調(diào)，同時(shí)間點(diǎn)可觀察到p-Akt蛋白表達(dá)的減少。
　　結(jié)論:1）Hyp-PDT對(duì)K562細(xì)胞具備有效的殺傷作用，且該作用呈光強(qiáng)度、金絲桃素濃度和光照時(shí)間依賴性;2）金絲桃素（濃度0.4μg/ml）孵育5h后，以595nm波長(zhǎng)LED燈（光強(qiáng)度為0.3 mW/cm2）照射4分鐘為K562細(xì)胞Hyp-PDT的最佳實(shí)施方案。3）實(shí)施Hyp-PDT后，電鏡下觀察凋亡增加，凋亡相關(guān)蛋白Cas

13、pase-3、Caspase-9活性上調(diào)，說(shuō)明Hyp-PDT可通過(guò)Caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4）LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)下調(diào)，電鏡下觀察到自噬體顯著減少，表明Hyp-PDT可通過(guò)抑制K562自噬促進(jìn)細(xì)胞死亡，該作用可能與Akt通路的抑制有關(guān)。5）Hyp-PDT可能通過(guò)抑制K562細(xì)胞的自噬，增加細(xì)胞凋亡率，起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
　　第三部分Hyp-PDT影響體外培養(yǎng)的人白血病細(xì)胞株K562凋亡與自噬的MAPK通路

14、機(jī)制
　　目的:進(jìn)一步深入探索p38MAPK、ERK、JNK等通路在Hyp-PDT對(duì)白血病細(xì)胞K562凋亡和自噬改變中的作用
　　方法:分別于光照前即刻、光照后4h、8h、16h收集細(xì)胞蛋白，檢測(cè)ERK、JNK、P38等通路蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:金絲桃素組光照后4h即出現(xiàn)p-ERK的表達(dá)，且其活性隨著時(shí)間而增加，而DMSO組并無(wú)ERK的激活。p-JNK的表達(dá)在Hyp-PDT后顯著增加，于光照后4h表達(dá)最強(qiáng)，p-P38的

15、表達(dá)在Hyp-PDT后亦有顯著增加。而總ERK、總JNK和P38表達(dá)較光照前無(wú)顯著。
　　結(jié)論:1）Hyp-PDT后ERK、JNK、P38三條通路的磷酸化表達(dá)均增加，但總ERK、總JNK、總P38水平并無(wú)改變，認(rèn)為Hyp-PDT對(duì)以上通路的調(diào)節(jié)主要通過(guò)增加其磷酸化程度，但并不上調(diào)其基因水平。2）Hyp-PDT可通過(guò)促進(jìn)ERK、JNK、P38三條通路的磷酸化表達(dá)，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。3）Hyp-PDT對(duì)K562自噬的抑制可能與ER

16、K、JNK、P38三條通路的磷酸化增加有關(guān)，其具體關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。
　　第四部分Hyp-PDT通過(guò)薄層玻片循環(huán)對(duì)人白血病細(xì)胞株K562和U937的殺傷作用
　　目的:使白血病細(xì)胞模擬體外血流環(huán)路進(jìn)行循環(huán)，探索其作用條件并驗(yàn)證Hyp-PDT對(duì)其的有效殺傷性
　　方法:體外培養(yǎng)白血病細(xì)胞K562和U937，加入濃度為0.4μg/ml的金絲桃素孵育5h后，參照第一部分中大鼠在體實(shí)驗(yàn)時(shí)的血液流速(9μl/s)，使細(xì)胞懸液在

17、微泵的作用下勻速通過(guò)薄層玻片系統(tǒng)，同時(shí)實(shí)施Hyp-PDT(光照波長(zhǎng)為596 nm，白血病細(xì)胞經(jīng)過(guò)外循環(huán)系統(tǒng)照射時(shí)間為15秒左右，光強(qiáng)度設(shè)定為1mW/cm2)。CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率，相差顯微鏡觀察Hyp-PDT前后K562和U937細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:1）CCK8顯示光照后K562細(xì)胞和U937細(xì)胞損傷嚴(yán)重，與光照前相比，其細(xì)胞活性分別下降了92.65％及98.27％。2）顯微鏡下可見Hyp-PDT后K562和U937