Dp71表達(dá)改變對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞HBE及肺腺癌細(xì)胞A549生物學(xué)特性的影響.pdf

1、Dystrophin（抗肌萎縮蛋白）基因位于人染色體Xp21.1-21.3，Dystrophin Dp71是由Dystrophin基因從位于62號(hào)外顯子和63號(hào)外顯子中的啟動(dòng)子區(qū)始動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯的整個(gè)蛋白。翻譯的整個(gè)Dp71蛋白保留了dystrophin蛋白的富含半胱氨酸區(qū)域和羧基端區(qū)域，在dystrophin基因編碼的多種蛋白之中Dp71蛋白是在非肌肉組織內(nèi)分布最廣的一種。關(guān)于Dp71的研究表明，在胚胎發(fā)育的多能干細(xì)胞中可以檢測(cè)到

2、Dp71的表達(dá)。Dp71除了分布在細(xì)胞膜外，還在細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)有一定量的表達(dá)。3'端的剪切主要產(chǎn)生Dp71f和Dp71d兩種剪切本。Dp71d剪切本主要分布在細(xì)胞核，Dp71f剪切本主要以細(xì)胞漿分布為主。相關(guān)的功能學(xué)研究表明，這兩種不同的剪切本在PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中起著同等重要的作用。通過(guò)和核纖層蛋白lamin B、核膜蛋白emerin結(jié)合，Dp71可以參與PC12細(xì)胞分裂的過(guò)程。Dp71還參與PC12細(xì)胞的細(xì)胞黏附等生物學(xué)行為。

3、目前大部分關(guān)于Dp71的研究局限于PC12細(xì)胞，在其他細(xì)胞中生物學(xué)功能尚未開(kāi)展任何研究。本課題選擇正常人支氣管上皮細(xì)胞HBE、建立Dp71過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，研究其生物學(xué)功能;選擇人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、建立Dp71過(guò)表達(dá)與表達(dá)抑制細(xì)胞模型;從在體裸鼠移植模型與離體細(xì)胞模型兩方面進(jìn)行Dp71相關(guān)生物學(xué)功能研究，以期為進(jìn)一步研究Dp71的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一章:過(guò)表達(dá)Dp71蛋白對(duì)于人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE的生物學(xué)特性的

4、影響
　　目的:建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dp71f和Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒和其對(duì)應(yīng)空白質(zhì)粒的HBE細(xì)胞株;從增殖、浸潤(rùn)，遷移能力方面探討其生物學(xué)特性，檢測(cè)過(guò)表達(dá)Dp71蛋白對(duì)HBE生物學(xué)特性的影響;篩選可能的靶標(biāo)分子。
　　方法:采用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71f和Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒的HBE細(xì)胞株。運(yùn)用CCK8，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5組HBE細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5組HBE細(xì)胞的侵襲能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5

5、組HBE細(xì)胞的遷移能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5組HBE細(xì)胞的細(xì)胞周期;Western blot檢測(cè)5組HBE細(xì)胞中靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dp71f和Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒和其對(duì)應(yīng)空白質(zhì)粒的HBE細(xì)胞株。5組用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株分別為（HBE-Dp71f,Control-Dp71f,HBE-Dp71d，Control-Dp71d，空白HBE細(xì)胞株）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株HBE-Dp71d和空白H

6、BE及Control-Dp71d細(xì)胞株相比;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71f真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株HBE-Dp71f和空白HBE及Control-Dp71f細(xì)胞株相比，HBE-Dp71d和HBE-Dp71f細(xì)胞株表現(xiàn)為增殖加快、浸潤(rùn)及侵襲能力加強(qiáng)、遷移能力加快、細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0+G1期縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot及q-RT-PCR檢測(cè)到，HBE-Dp71d和HBE-Dp71f細(xì)胞株中的lamin B1和Bcl2的mRNA和蛋白

7、的表達(dá)量增加。
　　結(jié)論:和空白HBE及轉(zhuǎn)染了對(duì)應(yīng)空白對(duì)照質(zhì)粒的HBE細(xì)胞株相比，HBE-Dp71d和HBE-Dp71f細(xì)胞株表現(xiàn)增殖加快、浸潤(rùn)及侵襲能力加強(qiáng)、遷移加快、細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0+G1期縮短，這極有可能與HBE-Dp71d和HBE-Dp71f細(xì)胞株中增高的lamin B1和Bcl2相關(guān)。
　　第二章:過(guò)表達(dá)Dp71蛋白對(duì)于人肺腺癌細(xì)胞A549的生物學(xué)特性的影響
　　目的:建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dp71f和Dp71d真核

8、表達(dá)質(zhì)粒和其對(duì)應(yīng)空白質(zhì)粒的A549細(xì)胞株;從增殖、浸潤(rùn)，遷移能力方面探討其生物學(xué)特性，檢測(cè)過(guò)表達(dá)Dp71蛋白對(duì)A549生物學(xué)特性的影響。
　　方法:采用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71f和Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒的A549細(xì)胞株，運(yùn)用CCK8，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5組A549細(xì)胞的增殖及克隆形成能力;Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5組A549細(xì)胞的侵襲能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5組A549細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

9、Dp71f和Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒和其對(duì)應(yīng)空白質(zhì)粒的A549細(xì)胞株，5組用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株分別為(A549-Dp71f,Control-Dp71f, A549-Dp71d，Control-Dp71d，空白A549細(xì)胞株)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71d真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株A549-Dp71d和空白A549及Control-Dp71d細(xì)胞株相比;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71f真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株A549-Dp71f和空白A549及Control-Dp71f細(xì)胞

10、株相比，A549-Dp71d和A549-Dp71f細(xì)胞株表現(xiàn)為增殖加快、浸潤(rùn)及侵襲能力加強(qiáng)、遷移能力加快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:和空白A549及轉(zhuǎn)染了對(duì)應(yīng)空白對(duì)照質(zhì)粒的A549細(xì)胞株相比，A549-Dp71d和A549-Dp71f細(xì)胞株表現(xiàn)增殖加快，浸潤(rùn)及侵襲能力加強(qiáng)，遷移加快。
　　第三章:RNA干擾抑制Dp71表達(dá)對(duì)于A549細(xì)胞系的生物學(xué)特性的影響
　　目的:建立沉默Dp71表達(dá)的RNA干擾質(zhì)粒，建立穩(wěn)

11、定轉(zhuǎn)染Dp71干擾質(zhì)粒的A549細(xì)胞株，分析其增殖、侵襲及遷移等生物學(xué)功能。
　　方法:運(yùn)用在線軟件設(shè)計(jì)沉默Dp71基因表達(dá)的位點(diǎn)，構(gòu)建Dp71的shRNA質(zhì)粒;采用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71的RNA干擾質(zhì)粒的A549細(xì)胞株，運(yùn)用CCK8，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組A549細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組A549細(xì)胞的侵襲能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組A549細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建沉默Dp71基

12、因表達(dá)的RNA干擾質(zhì)粒，篩選了一個(gè)消減效率最高的質(zhì)粒（2號(hào)質(zhì)粒）。成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2號(hào)干擾質(zhì)粒的A549細(xì)胞株。3組用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株分別為(A549-Dp71AS，A549-Dp71-E，空白A549細(xì)胞株)。和空白A549及對(duì)照細(xì)胞株A549-Dp71-E相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71的RNA干擾質(zhì)粒的細(xì)胞株A549-Dp71AS細(xì)胞株表現(xiàn)為增殖減慢、浸潤(rùn)及侵襲能力減弱、遷移能力減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:和空白A549及轉(zhuǎn)

13、染了對(duì)應(yīng)空白對(duì)照質(zhì)粒的A549細(xì)胞株相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了Dp71的RNA干擾質(zhì)粒的A549-Dp71AS細(xì)胞株表現(xiàn)為增殖減慢、浸潤(rùn)及侵襲能力減弱、遷移能力減弱。
　　第四章:RNAi沉默Dp71基因?qū)θ薃549細(xì)胞裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:建立人肺腺癌細(xì)胞A549的裸鼠皮下移植瘤模型，驗(yàn)證Dp71蛋白的消減在活體內(nèi)(In vivo)是否同樣具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
　　方法:采用將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組成瘤細(xì)胞胰酶消

14、化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，按照1～2×107個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液注射到裸鼠右側(cè)腋窩，觀察成瘤大小，測(cè)量生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果:與注射了空白A549細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了對(duì)照shRNA質(zhì)粒的A549細(xì)胞的兩組裸鼠相比，注射了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dp71干擾質(zhì)粒的A549細(xì)胞后的裸鼠移植瘤的成瘤潛伏期顯著延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度明顯減慢、瘤體體積顯著減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:裸鼠成瘤從在體實(shí)驗(yàn)水平證實(shí)了沉默A549細(xì)胞Dp71基因可以明顯抑