miR-146a對A549細(xì)胞增殖的影響及其基因多態(tài)性與肺癌的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　肺癌是全世界最常見而且研究報(bào)道其死亡率也是最高的惡性腫瘤，在全球許多的國家包括我國肺癌的死亡率已經(jīng)遙遙高于其他的惡性腫瘤，已位居全部惡性腫瘤死因的首位。許多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因的單核苷酸多態(tài)性決定著個(gè)體遺傳變異，是目前應(yīng)用最為重要的的遺傳標(biāo)記物之一。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，miRNA通常情況下主要以高度保守的方式參與其下游基因表達(dá)的調(diào)控。研究已經(jīng)證實(shí)miRNA的單核苷酸

2、多態(tài)性可能發(fā)生在miRNA從開始翻譯到成熟的過程中的任一環(huán)節(jié)。單核苷酸基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)已經(jīng)成為了檢查遺傳信息改變的重要標(biāo)志之一，已經(jīng)慢慢成為了人類基因組計(jì)劃走向應(yīng)用的關(guān)鍵的步驟,而且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其可以參與影響到疾病易感性、個(gè)體藥物反應(yīng)的敏感性。大量的研究證實(shí)microRNA在許多的惡性腫瘤中存在明顯的異常表達(dá)，其中miRNA在肺癌中明顯異常表達(dá)，而且與肺癌的惡

3、性程度、耐藥性均密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在腫瘤中表達(dá)明顯低于其對應(yīng)的癌旁組織。有意思的是，最近大量研究發(fā)現(xiàn)miR-146a與非小細(xì)胞性肺癌(nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制未知。此外，有大量的研究發(fā)現(xiàn)MIF在黑色素瘤、NSCLC、肝癌、前列腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌等多種癌組織中高表達(dá)。MIF參與了肺癌特別是NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，Kamimura等通過免疫組化檢

4、查發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的肺組織MIF過度表達(dá)，且研究證實(shí)MIF的表達(dá)情況與預(yù)后存在相關(guān)性。大量的研究報(bào)道MIF在許多的良性病變的正常的肺組織、NSCLC組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的組織中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)，且研究也證實(shí)高表達(dá) MIF的總體生存率低于低表達(dá)的。提示NSCLC中miR-146a及MIF都存在異常表達(dá)。本課題在此基礎(chǔ)上，通過RT-PCR法及免疫組化分別檢測miR-146a，MIF在NSCLC肺組織中的表達(dá)，并通過通過熒光素酶報(bào)告基因分析

5、驗(yàn)證MIF是否是miR-146a的下游靶基因，進(jìn)一步用轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物改變細(xì)胞內(nèi)的miR-146a的表達(dá)，從而觀察NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)特，并探討其對 NSCLC細(xì)胞中 MIF的表達(dá)與細(xì)胞增殖情況的影響及具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、對支氣管肺癌患者及良性病變患者手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本進(jìn)行 DNA提取并PCR檢測，分析良惡性病變miR-146a單核苷酸多態(tài)性的差異及其與良惡性病變臨床特征之間的相關(guān)性，分析基因多態(tài)

6、性在支氣管肺癌患者人群中的表達(dá)情況。
　　2、RT-PCR法檢測 miR-146a在 NSCLC組織和癌旁正常肺組織及四株NSCLC細(xì)胞株和正常人胚肺細(xì)胞中的表達(dá)，免疫組化檢測MIF在NSCLC組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)。
　　3、通過熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)方法探討MIF是否是miR-146a的特異性的下游靶基因，并將構(gòu)建的 miR-146a模擬物和 miR-146a陰性對照(NC)組通過基因轉(zhuǎn)染至 NSCLC細(xì)胞中，改變

7、 miR-146a的表達(dá)情況，從而通過 qPCR和Western blotting檢測MIF的mRNA及蛋白的表達(dá)情況的變化。此外，我們進(jìn)一步通過運(yùn)用了 MTT法檢測改變 miR-146a后細(xì)胞活力、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢等檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力，同時(shí)也運(yùn)用Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡，也觀察了天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)的活性的改變情況，同時(shí)通過Western blotting分析改變miR-146a后肺癌細(xì)胞中N

8、F-κB-p65蛋白的表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1、本研究發(fā)現(xiàn) miR-146a基因在肺癌患者中檢出率低于對照組,且其單核苷酸基因多態(tài)性與肺癌有相關(guān)性。
　　2、NSCLC細(xì)胞中的miR-146a低于正常胚肺組織。通過脂質(zhì)體將miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞后，與NC組比較，MIF蛋白及mRNA表達(dá)量都顯著下降(p<0.01)，細(xì)胞活力下降(p<0.01)，克隆數(shù)目減少(p<0.01)，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加(p

9、<0.01)。
　　3、NSCLC肺組織中的miR-146a表達(dá)量低于癌旁正常肺組織。MIF蛋白在NSCLC肺組織中的表達(dá)高于癌旁正常肺組織，且熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)MIF是miR-146a下游靶基因，miR-146模擬物轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞后，Caspase3活性升高(p<0.01），NF-κB p65磷酸化水平下調(diào)(p<0.01)。
　　結(jié)論：
　　在肺癌患者中miR-146a單核苷酸基因多態(tài)性與肺癌有相關(guān)性，miR-