凋亡及自噬在HVJ-E致A549和A549-DDP細(xì)胞死亡中的作用機(jī)制.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都有明顯升高的趨勢，肺癌是一種多因素的疾病，吸煙是引起肺癌的主要因素之一。目前肺癌的治療主要以手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療為主，但存活率普遍不高，所以，我們?nèi)孕鑼で笠环N新的方法來治療肺癌。研究表明，滅活的仙臺(tái)病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope，HVJ-E)不僅可以作為載體傳遞抗腫瘤藥物，激活多重抗腫瘤免疫，同時(shí)還能直接殺傷腫瘤。在本研究

2、中，我們發(fā)現(xiàn)HVJ-E可直接誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞(A549)、耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞(A549/DDP)死亡，并初步探討其抗腫瘤機(jī)制。
　　首先，我們通過實(shí)驗(yàn)觀察HVJ-E作用A549、A549/DDP細(xì)胞后，RIG-Ⅰ和IFN-β的表達(dá)情況。Western Blot和ELISA檢測顯示，經(jīng)HVJ-E刺激后，RIG-Ⅰ的表達(dá)量增加，誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。這表明HVJ-E與A549、A549/DDP細(xì)胞發(fā)生了融合，斷裂的

3、病毒基因組被RIG-Ⅰ識(shí)別，從而導(dǎo)致A549、A549/DDP細(xì)胞中的IFN-β含量隨HVJ-E濃度的增加而增加。
　　其次，我們探索HVJ-E對(duì)A549、A549/DDP細(xì)胞繁殖和生長的影響。用HVJ-E處理A549、A549/DDP細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均出現(xiàn)生長停滯、皺縮和破裂的現(xiàn)象，同時(shí)用Hoechst33258染色試劑盒可以觀察到細(xì)胞染色質(zhì)皺縮，細(xì)胞核碎裂。CCK-8檢測結(jié)果顯示，用100～800 MOI

4、HVJ-E分別處理A549、A549/DDP細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞的活力與對(duì)照組相比明顯下降，并呈劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)FACS法檢測顯示，經(jīng)HVJ-E處理后，A549、A549/DDP細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的凋亡，且呈劑量依賴關(guān)系。由此可以說明HVJ-E可以直接導(dǎo)致A549、A549/DDP細(xì)胞凋亡。
　　然后，我們用Western Blot法檢測p53、Bcl-2/Bax、Caspase信號(hào)通路的相關(guān)蛋白。p53的表達(dá)量隨HVJ-E濃

5、度增加有升高趨勢，Bcl-2/Bax卻呈下降趨勢，caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP、Caspase-8、Caspase-9隨HVJ-E濃度升高而活性升高，最終都可檢測到碎裂的形式。為進(jìn)一步確認(rèn)HVJ-E誘導(dǎo)的A549、A549/DDP細(xì)胞凋亡是否與Caspase通路有關(guān)，我們用caspase廣譜抑制劑Z-VAD-FMK分別預(yù)處理細(xì)胞后加HVJ-E處理，結(jié)果顯示，碎裂的caspase-3和PARP被顯著

6、抑制且細(xì)胞凋亡率也被顯著抑制。該實(shí)驗(yàn)證明Caspase信號(hào)通路參與HVJ-E誘導(dǎo)的A549、A549/DDP細(xì)胞凋亡。
　　接著，我們研究了MAPK通路是否參與HVJ-E誘導(dǎo)的A549、A549/DDP細(xì)胞凋亡。Western Blot法檢測p-p38、p-JNK、p-ERK1/2，結(jié)果p38、JNK、ERK1/2均被激活。為進(jìn)一步確認(rèn)MAPK通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，我們分別利用p38抑制劑SB203580(10μM)、JNK抑制劑

7、SP600125(A549:8μM、A549/DDP:10μM)、ERK抑制劑PD98059（20μM）預(yù)處理細(xì)胞30分鐘后再加HVJ-E，Western Blot結(jié)果顯示p38、JNK、ERK1/2磷酸化均被明顯抑制，同時(shí)用CCK-8測定的細(xì)胞活力顯示，SB203580、SP600125、PD98059均可以提高細(xì)胞活力。以上結(jié)果表面MAPK通路在HVJ-E誘導(dǎo)的A549、A549/DDP細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。
　　最后，我們研究

8、了自噬在HVJ-E引起A549、A549/DDP細(xì)胞死亡中的作用，我們利用GFP-LC3質(zhì)粒和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染A549、A549/DDP細(xì)胞，分別設(shè)陰性對(duì)照組、800 MOI HVJ-E、Rapa組，24小時(shí)后倒置熒光顯微鏡下觀察自噬現(xiàn)象。結(jié)果顯示，Rapa組出現(xiàn)大量自噬小體，HVJ-E處理組出現(xiàn)少量自噬小體。再用Western Blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示p-mTOR、p-p70S6K的表達(dá)量均

9、隨著HVJ-E濃度的增加而減小。由此說明自噬參與了HVJ-E促進(jìn)細(xì)胞的死亡。再利用Rapa和CQ分別預(yù)刺激A549、A549/DDP細(xì)胞，Western Blot法檢測可發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞，與HVJ-E組對(duì)照組相比，CQ組cleaved caspase-3和cleaved PARP的表達(dá)量明顯升高，Rapa組降低，而A549/DDP細(xì)胞的結(jié)果正好相反。CCK-8測定每組細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，A549細(xì)胞，CQ組的細(xì)胞死亡率最高;A549/