Notch信號通路活化在腎缺血-再灌注損傷中的作用及冬蟲夏草腎保護(hù)作用機制的研究.pdf

1、研究背景：急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)是一種常見的臨床危急重癥，常以氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂及全身各系統(tǒng)并發(fā)癥為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重危害人類健康。近年來，盡管ARF的基礎(chǔ)和臨床研究取得了較大進(jìn)展，但其發(fā)病率和死亡率仍居高不下，其主要原因是ARF發(fā)病原因錯綜復(fù)雜，發(fā)病機制迄今尚未明確，特別是很多ARF患者早期癥狀不明顯，直致病情發(fā)展到一定程度才出現(xiàn)血清肌酐升高，讓臨床醫(yī)生失去了適時救治的良好機會。因此

2、，近年來學(xué)者們將急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的概念引入腎臟病和急診醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，趨向?qū)RF更稱為急性腎損傷，這樣更有利于臨床醫(yī)生早期診斷和治療AKI，即在腎功能開始下降、甚至腎臟組織學(xué)有損傷、生物標(biāo)志物改變而GFR尚正常的階段將之識別并及早干預(yù)治療，以避免ARF的發(fā)生。如何早期識別和診斷AKI，何種機制和學(xué)說能更好的解釋AKI的發(fā)生發(fā)展過程已成為當(dāng)今腎臟病領(lǐng)域研究的熱點。
　　 腎缺血-再灌注損傷(

3、Ischemia reperfusion injury，IRI)是AKI的主要發(fā)病機制之一，這已被學(xué)者們的研究證實。而凋亡和炎癥在腎IRI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。IRI可引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，繼而內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間粘附分子增多，介導(dǎo)血流中的有形成分如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞粘附至血管內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞都可以通過各種網(wǎng)絡(luò)信息調(diào)控并刺激這些細(xì)胞分泌TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8等炎癥因子和MCP-1等化學(xué)趨化因子，通過這些炎性因

4、子再激活炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腎組織炎癥反應(yīng)發(fā)生，最終引起AKI。腎小管上皮細(xì)胞，作為腎臟的固有細(xì)胞，在腎IRI的環(huán)境下，其本身既可以因為缺血而受到損傷，也可以在某些因子的影響下轉(zhuǎn)化為炎癥細(xì)胞，分泌TNF-α、IL-2、IL-6等炎癥因子，參與了AKI的發(fā)生。實驗研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的拮抗劑通過抑制IRI相關(guān)的炎癥和腎小管上皮細(xì)胞凋亡發(fā)揮腎保護(hù)作用，提示TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子在AKI發(fā)生和治

5、療中起了十分重要的作用。
　　 本組前期研究已證明冬蟲夏草(Cordyceps Sinensis，CS)對糖尿病腎病、高血壓腎損傷模型鼠具有良好的腎保護(hù)作用，CS是否可以通過影響腎IRI誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)揮腎保護(hù)作用，其作用靶點是否與抑制Notch信號通路活化有關(guān)，目前國內(nèi)外未見報道。本研究擬以I/R大鼠模型和抗霉素A與腎小管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)模擬的體外的I/R模型為研究對象，一方面觀察I/R損傷時IL-6、TNF-α、MCP-

6、1和HIF-1α的表達(dá)狀況和Notch2/hes-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否被激活；另一方面用Notch信號通路關(guān)鍵酶()-secretase抑制劑和冬蟲夏草進(jìn)行干預(yù)實驗，其目的是：
　　 1.觀察腎I/R是否可上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表達(dá)，從而證實腎IRI存在炎癥和氧化應(yīng)激過程。
　　 2.觀察腎I瓜是否可激活Notch2/hes-1信號通路，活化的Notch2/hes-1信號通是否參

7、與IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的調(diào)控，證實Notch2/hes-1信號通路是否參與腎IRI相關(guān)的炎癥和氧化應(yīng)激過程。
　　 3.觀察冬蟲夏草是否通過抑制Notch2/hes-1信號通路的活化，繼而影響IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α的表達(dá)，通過抗炎和抗氧化發(fā)揮腎保護(hù)作用，從而探討冬蟲夏草的作用機制和靶點。
　　 實驗方法：
　　 1.60只健康雄性SD(Sprasue-Dawley

8、)大鼠用10％水合氯醛溶液(3.5mL/kg)腹腔注射局部浸潤麻醉后，從腹部正中切口，行右腎切除術(shù)，穩(wěn)定10min后將大鼠隨機分成假手術(shù)組(sham組)、缺血-再灌注組(I/R)、DAPT組(DAPT)、冬蟲夏草(CS)組4組，每組組內(nèi)再按再灌注時間分為24h、48h、72h3個時間點。缺血-再灌注組(I/R組)大鼠持續(xù)夾閉左腎蒂60min后恢復(fù)灌注，予以生理鹽水(2 mL/d)灌胃；DAPT組大鼠持續(xù)夾閉左腎蒂60min后恢復(fù)灌注，術(shù)

9、后予以γ-泌肽酶抑制劑DAPT(500μg/100g.d)灌胃；冬蟲夏草(CS)組大鼠持續(xù)夾閉左腎蒂60min后恢復(fù)灌注后，予以冬蟲夏草提取液(5g/kg.d)灌胃；假手術(shù)組(sham組)大鼠切除右腎后分離左輸尿管，但不夾閉左腎蒂，術(shù)后予以生理鹽水(2 mL/d)灌胃，分別在上述時間點處死大鼠，處死前收集尿液和血液。檢測各組大鼠腎功能(BUN、Scr)情況；ELISA法檢測各組大鼠TNF-α、IL-6水平；比色法檢測各組大鼠尿NAG水平

10、，HE染色觀察各組大鼠腎臟病理，并半定量評分法觀察各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷；RT-PCR法檢測各組大鼠Notch2、hes-1 mRNA的表達(dá)；免疫激光共聚焦法和western blot法檢測各組大鼠Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　 2.首先用MTT法觀察不同濃度DAPT(0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，100μmol/L)和CS提取液(10mg/L，20mg/L，40mg

11、/L，80mg/L)對NRK52E增殖的影響，確定DAPT工作液和CS工作液的濃度。
　　 3.將NRK-52E細(xì)胞置于低糖型完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分為normal組、缺血-再灌注組(I/R組)、DAPT組和CS組4組。I/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞模型用下法建立：用不含血清的D-Hanks液+抗霉素A(10μmol/L)模擬缺血3h，恢復(fù)低糖型完全DMEM培養(yǎng)基模擬再灌注。normal組NRK-52E不作任何處理，正常條件

12、培養(yǎng)：DAPT組NRK-52E造模前24h和再灌注時用含10μmol/L DAPT工作液處理，直至收集細(xì)胞，組內(nèi)按再灌注時間分為24h、48h、72h3個時間點；CS組(n=15)：按上述方法造模，造模前24h預(yù)先用含40mg/L的CS工作液處理，再灌注時用CS工作液培養(yǎng)，直至收集細(xì)胞，組內(nèi)按再灌注時間分為24h、48h、73h3個時間點。細(xì)胞免疫化學(xué)熒光法和Western blot法觀察各組NRK-52E細(xì)胞Notch2、hes-1、

13、MCP-1、HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，腎I/R時大鼠體內(nèi)血清BUN和Scr升高，尿中NAG排出增多，腎臟病理出現(xiàn)腎小管刷狀緣丟失、小管上皮細(xì)胞變性壞死、部分小管擴張、管型形成，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤等病變，提示腎I/R大鼠AKI模型建立成功。腎I/R時大鼠血清TNF-α、IL-6水平增高(P<0.01)；腎組織中Notch2、hes-1、MCP-1、HIF-1α的mRNA和/

14、或蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，并均于再灌注后24h達(dá)高峰。而DAPT干預(yù)能改善腎小管間質(zhì)損傷，改善腎功能，降低血清TNF-α、IL-6水平(P<0.05或P<0.01)，下調(diào)Notch2、hes-1、NF-κB2、MCP-1mRNA和/或蛋白表達(dá)，上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)(P<0.01)，提示DAPT可選擇性地阻斷腎小管上皮細(xì)胞Notch2/hes-1信號通路，調(diào)控IL-6、TNF-α、MCP-1、HIF-1α等轉(zhuǎn)錄，有效地控制腎IR

15、I時所誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激過程，具有良好的腎保護(hù)作用。
　　 2.體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，CS干預(yù)后可改善I/R大鼠腎小管間質(zhì)損傷，改善其腎功能，同時降低血清TNF-α、IL-6及尿NAG水平(P<0.01)，下調(diào)Notch2/hes-1、MCP-1mRNA和/或蛋白表達(dá)(P<0.01)，上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)(P<0.01)，提示CS對I/R時的腎保護(hù)作用可能是通過抑制Notch信號通路活化，調(diào)控IL-6、TNF-α、MCP-1、

16、HIF-1等基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。
　　 3.MTT結(jié)果顯示，與對照組OD值相比較，濃度為0.1～10μmol/LDAPT組和濃度為10-40mg/L CS NRK52E的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；溶度為100μmol/L的DAPT和80mg/L的CS均能顯著抑制NRK-52E的增值(P<0.01)。因此，我們在下面的實驗選擇DAPT和CS的處理溶度為10μmol/L和40mg/L。
　　 結(jié)論：
　　

17、 1.腎IRl時IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α表達(dá)上調(diào)，證實腎IRI存在炎癥和氧化應(yīng)激過程。
　　 2.腎IRI誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞Notch2/hes-1信號通路活化，活化的Notch2/hes-1信號通路能調(diào)控IL-6、TNF-α、MCP-1和HIF-1α等的轉(zhuǎn)錄。
　　 3.冬蟲夏草能減輕腎IRI時腎臟病理損傷，改善腎功能，有效抑制Notch2/hes-1信號通路的活化，下調(diào)IL-6、TNF-α、MC