氯離子共轉運體KCC2在癲癇發(fā)病機制中的作用及其作為抗癲癇靶點的研究.pdf

1、癲癇是一種常見的中樞神經系統(tǒng)疾病，誘發(fā)因素繁多，發(fā)病機制至今尚未完全闡明，但各種癲癇發(fā)作的本質都是由中樞神經系統(tǒng)興奮一抑制系統(tǒng)失衡，從而導致某些神經元群發(fā)生突然、過度和同步化異常放電所引起的行為異常。GABA及其受體系統(tǒng)作為成年中樞神經系統(tǒng)的主要抑制體系，在癲癇的發(fā)病機制中扮演了重要的角色。過去的研究表明GABA遞質水平和受體數(shù)目類型的改變參與了癲癇的發(fā)病機理，除此之外，最近的研究同時也預示著細胞內氯離子穩(wěn)態(tài)可能也參與了癲癇的發(fā)病機制，

2、而氯離子內穩(wěn)態(tài)的調節(jié)與氯離子共轉體KCC2密切相關。本研究利用CTZ癲癇模型，在離體和整體水平首次系統(tǒng)的研究了KCC2與癲癇發(fā)病機制的關系及其可能的保護機制。
　　本論文研究的第一部分著重闡明KCC2在癲癇發(fā)病進程中的作用及其機制。實驗結果表明無論在培養(yǎng)細胞、海馬腦片還是整體動物上，致癇藥物CTZ都可以誘發(fā)癲癇樣的活動，并導致神經元膜上KCC2表達的下調;在離體腦片上進一步發(fā)現(xiàn)CTZ作用后，會引起神經元對氯離子泵出功能的減弱以及引

3、起神經元氯離子平衡電位(EGABA)向去極化方向偏移;利用KCC2抑制劑furosemide阻斷KCC2活性可以異化CTZ誘發(fā)的癲癇活動的出現(xiàn);而通過分子生物學手段在培養(yǎng)海馬神經元過表達KCC2能夠顯著抑制CTZ誘發(fā)癲癇樣發(fā)電的細胞比例。由此，第一步分結果提示了KCC2功能性下調是CTZ誘發(fā)癲癇的基本機制之一。
　　本論文研究的第二部分針對KCC2作為靶點，研究了KCC2抑制劑在癲癇中對神經元膜上KCC2蛋白的保護作用，以期闡明通

4、過對KCC2蛋白的調控保護，并將其作為抗癲癇研究的新領域。分子生物學、形態(tài)學和電生理學研究結果發(fā)現(xiàn)furosemide作為KCC2阻斷劑，在急性癲癇狀態(tài)下可以穩(wěn)定神經元細胞膜上的KCC2蛋白使之不下膜，furosemide也阻斷了CTZ引起的神經元EGABA向去極化方向偏移，并進一步發(fā)現(xiàn)furosemide對KCC2蛋白及功能的保護作用不是建立在其抗癲癇作用基礎之上。我們進一步的研究發(fā)現(xiàn)CTZ急性處理海馬腦片誘導KCC2下膜的同時還會導

5、致GABA電流的減小、GABA受體β2/β3亞單位的減少，而當furosemide與CTZ共同作用時，furosemide還具有保護GABAA受體和GABA電流的作用。進一步對其機制的研究發(fā)現(xiàn)，膜上KCC2蛋白可能對GABA受體的分布具有調控作用。實驗發(fā)現(xiàn)應用分子生物學手段在培養(yǎng)海馬神經元中特異性地下調KCC2蛋白的表達后，神經元總GABA電流密度不變而mIPSCs幅度減小以及突觸外受體介導的tonic IPSCs密度增加，且這種增加不

6、是由包含δ亞基的突觸外GABAA受體增加導致的，提示了可能會是包含α5亞基的突觸外GABAA受體的增加介導的。由此，電生理結果結合形態(tài)學結果提示了furosemide在保護KCC2膜上蛋白的同時還具有穩(wěn)定抑制性突觸內外的GABAA受體的分布及其功能的作用。
　　本論文結果闡明了神經元膜上KCC2蛋白的下調是癲癇誘發(fā)及其進展的重要機制之一;而KCC2蛋白下調會影響GABAA受體在抑制性突觸的空間分布，這種作用可能是癲癇或者其他疾病之