氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用及其作為抗癲癇靶點(diǎn)的研究.pdf

1、癲癇是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，誘發(fā)因素繁多，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但各種癲癇發(fā)作的本質(zhì)都是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮一抑制系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致某些神經(jīng)元群發(fā)生突然、過度和同步化異常放電所引起的行為異常。GABA及其受體系統(tǒng)作為成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制體系，在癲癇的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色。過去的研究表明GABA遞質(zhì)水平和受體數(shù)目類型的改變參與了癲癇的發(fā)病機(jī)理，除此之外，最近的研究同時(shí)也預(yù)示著細(xì)胞內(nèi)氯離子穩(wěn)態(tài)可能也參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制，

2、而氯離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)與氯離子共轉(zhuǎn)體KCC2密切相關(guān)。本研究利用CTZ癲癇模型，在離體和整體水平首次系統(tǒng)的研究了KCC2與癲癇發(fā)病機(jī)制的關(guān)系及其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　本論文研究的第一部分著重闡明KCC2在癲癇發(fā)病進(jìn)程中的作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)論在培養(yǎng)細(xì)胞、海馬腦片還是整體動(dòng)物上，致癇藥物CTZ都可以誘發(fā)癲癇樣的活動(dòng)，并導(dǎo)致神經(jīng)元膜上KCC2表達(dá)的下調(diào);在離體腦片上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CTZ作用后，會(huì)引起神經(jīng)元對(duì)氯離子泵出功能的減弱以及引

3、起神經(jīng)元氯離子平衡電位(EGABA)向去極化方向偏移;利用KCC2抑制劑furosemide阻斷KCC2活性可以異化CTZ誘發(fā)的癲癇活動(dòng)的出現(xiàn);而通過分子生物學(xué)手段在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元過表達(dá)KCC2能夠顯著抑制CTZ誘發(fā)癲癇樣發(fā)電的細(xì)胞比例。由此，第一步分結(jié)果提示了KCC2功能性下調(diào)是CTZ誘發(fā)癲癇的基本機(jī)制之一。
　　本論文研究的第二部分針對(duì)KCC2作為靶點(diǎn)，研究了KCC2抑制劑在癲癇中對(duì)神經(jīng)元膜上KCC2蛋白的保護(hù)作用，以期闡明通

4、過對(duì)KCC2蛋白的調(diào)控保護(hù)，并將其作為抗癲癇研究的新領(lǐng)域。分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)furosemide作為KCC2阻斷劑，在急性癲癇狀態(tài)下可以穩(wěn)定神經(jīng)元細(xì)胞膜上的KCC2蛋白使之不下膜，furosemide也阻斷了CTZ引起的神經(jīng)元EGABA向去極化方向偏移，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)furosemide對(duì)KCC2蛋白及功能的保護(hù)作用不是建立在其抗癲癇作用基礎(chǔ)之上。我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)CTZ急性處理海馬腦片誘導(dǎo)KCC2下膜的同時(shí)還會(huì)導(dǎo)

5、致GABA電流的減小、GABA受體β2/β3亞單位的減少，而當(dāng)furosemide與CTZ共同作用時(shí)，furosemide還具有保護(hù)GABAA受體和GABA電流的作用。進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，膜上KCC2蛋白可能對(duì)GABA受體的分布具有調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用分子生物學(xué)手段在培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中特異性地下調(diào)KCC2蛋白的表達(dá)后，神經(jīng)元總GABA電流密度不變而mIPSCs幅度減小以及突觸外受體介導(dǎo)的tonic IPSCs密度增加，且這種增加不

6、是由包含δ亞基的突觸外GABAA受體增加導(dǎo)致的，提示了可能會(huì)是包含α5亞基的突觸外GABAA受體的增加介導(dǎo)的。由此，電生理結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果提示了furosemide在保護(hù)KCC2膜上蛋白的同時(shí)還具有穩(wěn)定抑制性突觸內(nèi)外的GABAA受體的分布及其功能的作用。
　　本論文結(jié)果闡明了神經(jīng)元膜上KCC2蛋白的下調(diào)是癲癇誘發(fā)及其進(jìn)展的重要機(jī)制之一;而KCC2蛋白下調(diào)會(huì)影響GABAA受體在抑制性突觸的空間分布，這種作用可能是癲癇或者其他疾病之