MTX對映體誘導A549細胞耐藥后EGFR基因表達與侵襲轉移差異的研究.pdf

1、目的:建立耐氨甲蝶呤(MTX)對映體的A549細胞株模型,觀察MTX/A549耐藥細胞的生物學特征,侵襲轉移能力,探討表皮生長因子受體(EGFR)在MTX對映體L-(+)-MTX和D-(-)-MTX耐藥A549細胞株中的表達及對啟動子甲基化狀態(tài)分析,以期發(fā)現(xiàn)不同MTX對映體作用腫瘤細胞而引起腫瘤轉移能力差異的機制,為臨床合理使用MTX對映體藥物減少腫瘤轉移提供新的理論依據(jù)。
　　方法:采用濃度遞增結合低劑量持續(xù)誘導,獲得耐受35μ

2、mol/L MTX對映體的細胞系,分別命名為L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549;倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化;MTT法繪制細胞生長曲線;MTT方法檢測L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549細胞的耐藥指數(shù);通過平板劃痕實驗檢測L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549細胞遷移能力;采用雙層軟瓊脂克隆形成實驗檢測L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549細胞的克

3、隆形成率和觀察集落的形態(tài);采用RT-PCR方法測定親本A549細胞、L-(+)-MTX/A549和D-(-)-MTX/A549兩種耐藥細胞株中EGFR基因表達;采用MSP方法分析EGFR基因啟動子甲基化狀態(tài)。
　　結果:①采用濃度遞增結合低劑量持續(xù)誘導的方法,成功建立MTX不同對映體A549細胞的耐藥細胞株,L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐藥指數(shù)分別為6.12的和20.75。②倒置相差顯微鏡觀察耐藥細胞

4、株的形態(tài),親本A549細胞呈梭形生長,大小均一,分布均勻,排列緊密,貼壁牢固。D-(-)-MTX/A549細胞呈梭狀生長,與親本細胞形態(tài)接近,粘接明顯分散。L-(+)-MTX/A549細胞有部分細胞呈梭形生長,另外一部分細胞呈團生長,粘附相近;③細胞生長曲線顯示D-(-)-MTX/A549的增殖略慢于親本A549細胞,而L-(+)-MTX/A549的增值最慢;④72小時后D-(-)-MTX/A549細胞的遷移能力大于L-(+)-MTX/

5、A549細胞;⑤軟瓊脂實驗發(fā)現(xiàn)D-(-)-MTX/A549細胞、L-(+)-MTX/A549細胞和親本A549細胞的克隆形成率(％)分別為(1.38±0.17)、(1.36±0.13)和(1.37±0.15),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);⑥親本A549細胞、L-(+)-MTX/A549細胞均有EGFR mRNA表達,其IDV值分別為(6630±64)、(3697±27),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而的D-(-)-MTX/A

6、549細胞中EGFR基因不表達;⑦MSP的結果顯示,親本A549、D-(-)-MTX/A549和L-(+)-MTX/A549三種細胞中均發(fā)生甲基化。
　　結論:D-(-)-MTX/A549耐藥細胞在體外運動、增殖能力均大于L-(+)-MTX耐藥細胞,從而說明MTX對映體耐藥細胞后細胞的轉移力具有手性差異;MTX誘導耐藥后細胞株中EGFR mRNA發(fā)生變化,且在兩種對映體細胞株間具有明顯的手性差異,且MTX可能通過改變EGFR基因啟