齊墩果酸誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡蛋白質(zhì)組差異表達(dá)分析及細(xì)胞內(nèi)外藥物含量測(cè)定.pdf

1、目的:齊墩果酸在臨床上被廣泛用于治療肝炎,近年的研究發(fā)現(xiàn)其還有免疫雙向調(diào)解作用、抗炎抗病毒及抗癌活性等,療效甚好,但其作用機(jī)制尚不明確。本研究采用MTT法,流式細(xì)胞法等證實(shí)OA對(duì)A549細(xì)胞具有增殖抑制作用。進(jìn)一步用HPLC法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)外OA的含量,考察相同藥物濃度與A549不同的作用時(shí)間和不同藥物濃度作用相同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)外的OA含量變化,以研究OA在A549細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)作用。再結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)OA誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549做比較蛋白

2、質(zhì)組學(xué)分析,監(jiān)測(cè)藥物在作用過(guò)程中,人肺癌細(xì)胞A549蛋白質(zhì)的變化,以期能從分子水平尋找出可能介導(dǎo)OA作用的靶點(diǎn)、生物分子,推測(cè)OA的可能作用機(jī)制,為該藥在臨床上的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 方法:1、建立了OA對(duì)A549細(xì)胞的增殖凋亡的研究模型。培養(yǎng)A549細(xì)胞,并用MTT法觀察了OA對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞凋亡的情況,用DAPI染色法觀察了藥物作用前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和熒光強(qiáng)度的變化。

3、r>　　 2、建立了細(xì)胞內(nèi)外OA的HPLC定量研究法。細(xì)胞經(jīng)藥物作用后分別收集細(xì)胞內(nèi)外液,然后通過(guò)HPLC來(lái)進(jìn)行定量分析。HPLC分析色譜條件是:色譜柱為Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm,5μm):流動(dòng)相為甲醇-水(pH3.38)=90:10(V/V);流速為1.0 ml/min;柱溫是30℃:檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm;進(jìn)樣量20μl。
　　 3、分別提取空白細(xì)胞和OA作用后的細(xì)胞的總蛋白質(zhì),采用雙向凝膠電泳技

4、術(shù)(2-DE)分離蛋白質(zhì),得到的凝膠用硝酸銀染色,PDQuest軟件分析識(shí)別差異表達(dá)蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶切差異蛋白點(diǎn),用基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析酶切的蛋白點(diǎn),得到的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)在Mascot軟件的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢驗(yàn)證。
　　 結(jié)果:1、通過(guò)MTT方法證實(shí)了在10-200μg/ml的范圍內(nèi),OA對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用明顯,并且在200μg/ml時(shí)能達(dá)到80％的抑制率,呈時(shí)間和濃度

5、依賴性關(guān)系,24、48、72h的IC50值為109.45、80.08、78.21μg/ml。通過(guò)DAPI染色后觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化,可以觀察到OA作用24h以后,A549的細(xì)胞核出現(xiàn)形態(tài)異常,在小劑量80μg/ml時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)固縮,形成很多顆粒物質(zhì),或者細(xì)胞核破裂形成碎片,熒光強(qiáng)度增加,細(xì)胞凋亡開始發(fā)生,高濃度(200μg/ml)時(shí)伴有明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA在80、120、200μg/ml時(shí)對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑

6、制作用與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,各組總凋亡率(n=3,X±S)(%)分別為:16.37±2.17,40.97±2.72,86.14±1.43,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2、在上述色譜條件下細(xì)胞內(nèi)液中OA在1.02～20.4μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996),平均回收率為97.57%,日內(nèi)精密度的RSD分別為3.03%,2.56%,1.99%,日間精密度的RSD分別為2.42%,1.79%,2.5

7、9%;細(xì)胞外液中OA在5.1～81.6μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9998),平均回收率為97.37%,日內(nèi)精密度的RSD為0.63%,1.99%,2.36%,日間精密度的RSD為3.52%,1.19%,1.21%,表明精密度良好。
　　 3、通過(guò)雙向電泳后得到的凝膠圖經(jīng)PDQuest8.0軟件分析后,檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)約有1000個(gè),選取其中二倍以上有顯著性差異的蛋白點(diǎn)酶解后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

8、后,鑒定出4個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白點(diǎn)(p＜0.05),其中下調(diào)的蛋白有TPx-1、Actin和BTF3,上調(diào)的蛋白有Hsp27。
　　 結(jié)論:通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),DAPI染色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)證明了OA對(duì)A549細(xì)胞有增殖抑制作用,并且通過(guò)分析細(xì)胞內(nèi)外藥物濃度的變化初步探討了OA在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)機(jī)制,再經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)檢索在空白細(xì)胞組和藥物處理組的2-DE圖譜中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),初步鑒定出4種蛋白質(zhì),提示這些蛋白可能與OA的抗