ATRA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化前后蛋白質(zhì)組2-DE分離條件的優(yōu)化和差異表達(dá)蛋白分析.pdf

1、目的: 以ATRA誘導(dǎo)的方式建立人急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL60向粒系分化的模型，采用優(yōu)化的雙向電泳方法對(duì)分化前后的細(xì)胞全蛋白進(jìn)行分離，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，為HL60細(xì)胞向粒系分化時(shí)的蛋白分子機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1.采用全反式維甲酸對(duì)HL60細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。通過(guò)MTT、流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞增殖情況和CD11b細(xì)胞表面分化抗原的表達(dá)，選擇最適的藥物濃度和誘導(dǎo)時(shí)間；再通過(guò)細(xì)胞化學(xué)

2、染色、細(xì)胞透射電鏡觀察、細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)對(duì)分化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建分化模型。 2.對(duì)影響雙向電泳分離效果的關(guān)鍵條件進(jìn)行改進(jìn)。主要通過(guò)對(duì)比不同的蛋白提取方法；對(duì)比傳統(tǒng)等點(diǎn)聚焦條件50V5h，100V2h，500V2h，1000V2h，1000～8500V線性升壓4h，8500V70000Vh和改良等點(diǎn)聚焦條件450V2h，4380V2h，4380V1h33min所得的雙向電泳結(jié)果的蛋白分離情況和重復(fù)性，選取最適的蛋白提取方法和改良

3、等點(diǎn)聚焦條件。 3.采用改良雙向電泳分離技術(shù)對(duì)細(xì)胞全蛋白進(jìn)行分離，運(yùn)用PDQuest軟件分析HL60細(xì)胞分化前后蛋白表達(dá)差異，并用基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定。 4.經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，得到肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF），使用Mascot軟件在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

4、 結(jié)果: 1.ATRA明顯抑制HL60細(xì)胞增殖，并隨藥物濃度的增加，抑制效果也越顯著；2μM的ATRA連續(xù)作用HL60細(xì)胞5天即有90％以上的細(xì)胞有粒系分化標(biāo)志抗原CD11b的表達(dá)。細(xì)胞化學(xué)染色和透射電鏡結(jié)果亦表明誘導(dǎo)后的HL60細(xì)胞向粒系分化。細(xì)胞周期阻滯于G0～G1期，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 2.采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白提取方法和改良后雙向電泳條件，所得蛋白點(diǎn)數(shù)為1102±7.40，重復(fù)性為74.82±6.44％。

5、 3.將分化前后的HL60細(xì)胞全蛋白經(jīng)過(guò)改良雙向電泳技術(shù)分離，PDQuest軟件比對(duì)，MAIDI-TOF分析，發(fā)現(xiàn)有25個(gè)蛋白點(diǎn)僅在未分化組的凝膠譜中找到，有15個(gè)蛋白點(diǎn)僅在分化組的細(xì)胞蛋白表達(dá)譜中找到。其中有的是癌基因表達(dá)蛋白，有的是抑癌基因表達(dá)蛋白，還有的則參與凋亡過(guò)程等。 結(jié)論: 建立了ATRA誘導(dǎo)HL60細(xì)胞向粒系分化的完整模型。改良的雙向電泳技術(shù)明顯提高了藥物作用前后細(xì)胞總蛋白的分離效果，其重復(fù)性良好。