葉酰聚谷氨酸合成酶在氨甲蝶呤對映體耐藥A549細(xì)胞株中的表達及臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:探討葉酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)在氨甲蝶呤(MTX)對映體(L-(+)-MTX和D-(-)-MTX)耐藥A549細(xì)胞株中的表達,并應(yīng)用于臨床病例。
　　方法:用SYBR Green I為熒光染料,以β-actin作參照,建立檢測FPGS mRNA的實時熒光定量PCR方法;根據(jù)循環(huán)閾值(Ct值)、標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、斜率、重復(fù)性曲線、熔解曲線、擴增效率曲線等進行方法學(xué)評價;并用該方法檢測MTX對映體耐藥細(xì)胞株及應(yīng)用MTX耐藥的

2、白血病骨髓細(xì)胞中FPGS基因表達;用蛋白免疫印跡方法測定肺癌A549細(xì)胞株和MTX對映體耐藥A549細(xì)胞株中的FPGS蛋白表達。
　　結(jié)果:建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板濃度有良好的線性關(guān)系,FPGS和β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.9968和0.9987,斜率分別為-3.595和-3.740,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為1.27％~2.95%,批間CV為3.82%,熔解曲線均呈單個特異峰,擴增效率相似(斜率為0.0217);15μ

3、mol/L、35μmol/L、55μmol/L各濃度點L-(+)-MTX和D-(-)-MTX兩組間FPGS mRNA表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(0.80±0.09 vs2.04±0.34,3.43±0.44 vs8.11±0.87,2.00±0.22 vs0.59±0.11,P＜0.05);15μmol/L L-(+)-MTX和D-(-)-MTX兩組間FPGS蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.85±0.12 vs1.62±0.24, P

4、＜0.05);濃度為35μmol/L、55μmol/L時,L-(+)-MTX和D-(-)-MTX兩組間蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);白血病患者應(yīng)用MTX耐藥后FPGS相對含量是用前的0.35±0.04倍,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:建立的實時熒光定量PCR檢測FPGS mRNA的方法重復(fù)性好、特異度高、穩(wěn)定性好、簡單易行且成本低廉,可用于FPGS基因含量分析;白血病患者應(yīng)用MTX耐藥前后