毛細(xì)管電泳免疫-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)測(cè)定氨甲蝶呤對(duì)映體耐藥A549細(xì)胞株中葉酰聚谷氨酸合成酶.pdf

1、背景：氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是許多葉酸途徑抗腫瘤藥物的前體，存在L-(+)-MTX和D-(-)-MTX 2種形式的對(duì)映體，廣泛應(yīng)用于淋巴瘤、急性白血病和肺癌等多種腫瘤的治療，作為MTX代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一的細(xì)胞內(nèi)葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)，其含量和活性直接與MTX作用效果相關(guān)，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，但有關(guān)FPGS定量檢測(cè)的報(bào)道甚少。 目的：

2、建立一種FPGS定量檢測(cè)方法，優(yōu)化該方法實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)該方法的特異性，分離度及靈敏度等進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用該方法檢測(cè)不同氨甲蝶呤(MTX)對(duì)映體作用肺癌A549細(xì)胞株前后細(xì)胞株內(nèi)FPGS表達(dá)含量，觀察FPGS含量變化，為深入探討腫瘤耐藥機(jī)制提供新的研究平臺(tái)?！　》椒ǎ菏紫壤么髣┝繚舛冗f增沖擊法誘導(dǎo)耐藥的方法分別誘導(dǎo)建立25μmol/LL-(+)-MTX耐藥細(xì)胞株和25 μmol/LD-(-)-MTX耐藥細(xì)胞株

3、，以敏感細(xì)胞株作為細(xì)胞內(nèi)FPGS表達(dá)含量的對(duì)照；對(duì)濕重均約為100mg的敏感細(xì)胞株、25μmol/L/LL-(+)-MTX耐藥細(xì)胞株和25μmol/L D-(-)-MTX耐藥細(xì)胞株的三組細(xì)胞株采用液氮中反復(fù)凍融的方法，完全破壞細(xì)胞，獲取細(xì)胞蛋白上清提取液；提取液經(jīng)經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western blot)分析；細(xì)胞提取液在室溫暗室里與經(jīng)過(guò)透析標(biāo)記法，采用異硫氰酸熒光素(fluorescein i

4、sothiocynate，F(xiàn)ITC)衍生標(biāo)記的FPGS抗體反應(yīng)30 min，使標(biāo)記抗體與FPGS發(fā)生特異性非競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)；反應(yīng)后立即采取毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(micellar electrokinetie capillary chromatography,MECC)法結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(1aser-induced fluorescence，LIF)檢測(cè)技術(shù)的毛細(xì)管電泳免疫.激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)(immunity analysis 0f c

5、apillaryelectrophoresis-1aser-induced fluorescence，CEIA-LIF)分離檢測(cè)FITC衍生標(biāo)記FPGS以及FPGS抗原抗體復(fù)合物，檢測(cè)MTX不同對(duì)映體作用肺癌A549細(xì)胞株中FPGS表達(dá)含量的。 結(jié)果：經(jīng)SDS-PAGE確認(rèn)FPGS分子量約為66 000D，WB實(shí)驗(yàn)確認(rèn)FPGS與其特異性抗體沒(méi)有其他條帶出現(xiàn)，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)初步定量：25μmol/L L-(+)-MTX和25

6、μmol/L D-(-)-MTX誘導(dǎo)耐藥細(xì)中FpFPGS的表達(dá)含量分別為敏感細(xì)胞的52.14％和60.06％；CEIA-LIF檢測(cè)方法分離標(biāo)記FPGS抗體與免疫復(fù)合物的時(shí)間分別為7.1min、8.9min，且在10min內(nèi)即完成蛋白的分離和檢測(cè)，分離度R=4。5；CEIA.LIF檢測(cè)FPGS的方法在敏感細(xì)胞株內(nèi)檢出限為0.6788mg/μl細(xì)胞；運(yùn)用CEIA-LIF檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FPGS的表達(dá)含量的方法，計(jì)算得出25μmol/L L-(+)

7、-MTX和25 μmol/L D-(-)-MTX誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞中FPGS的表達(dá)含量分別為敏感細(xì)胞的46.59％和48.36％，該結(jié)果和經(jīng)典的WB初步定量結(jié)果，經(jīng)SPSS 13.0 Wald模式處理軟件分析得知P>0.05，說(shuō)明兩者沒(méi)有顯著差異。 結(jié)論：CEIA-LIF檢測(cè)FPGS方法具有檢測(cè)速度快，測(cè)定時(shí)間短的特點(diǎn)。且通過(guò)經(jīng)典的WB法做對(duì)照，該方法具有高度的特異性和FPGS定量的準(zhǔn)確性。通過(guò)該方法中運(yùn)用了FITC標(biāo)記技術(shù)、MEC