親和毛細(xì)管電泳法測(cè)定二氫葉酸還原酶的活性及與氨甲蝶呤對(duì)映體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù).pdf

1、親和毛細(xì)管電泳(ACE)是高效毛細(xì)管電泳(HPCE)技術(shù)的一種分離模式，結(jié)合了物質(zhì)之間的親和作用和毛細(xì)管電泳分離的原理，主要是指在電泳過(guò)程中具有生物專一性親和力的兩種分子受體(receptor)和其配體(Iigand)間，發(fā)生了特異性相互作用，形成了受體一配體復(fù)合物，通過(guò)研究受體或配體在發(fā)生親和作用前后的電泳譜圖變化，可獲得有關(guān)受體-配體親和力大小、結(jié)構(gòu)變化、作用產(chǎn)物等方面的信息。目前ACE技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和生物化學(xué)等研究領(lǐng)域，

2、如核酸片段的特異性識(shí)別、蛋白相互作用、競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析、藥物一受體和藥物一蛋白作用研究等。通過(guò)改善被分析物的電泳遷移行為，可提高分析靈敏度、選擇性和分辨率。 二氫葉酸還原酶(DHtFR)和氨甲蝶呤(MTX)手性對(duì)映體是本課題的主要研究對(duì)象。本論文首次用親和毛細(xì)管電泳法測(cè)定DHFR活性及與MTX對(duì)映體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，觀察MTX對(duì)映體對(duì)DHFR是否有立體選擇性，為臨床使用對(duì)映體藥物時(shí)要考慮其在代謝過(guò)程中對(duì)關(guān)鍵酶的立體選擇性提供線索。

3、 第一部分親和毛細(xì)管電泳法測(cè)定二氫葉酸還原酶的活力 二氫葉酸還原酶(DHFR)在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的參與下，催化7，β-二氫葉酸(FH2)還原成5，6，7，8-四氫葉酸(FH4)，同時(shí)NADPH轉(zhuǎn)化為NADP+。由于FH4作為一碳單位的載體，參與體內(nèi)DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的生物合成，因而該酶對(duì)于生物體的新陳代謝有重要的作用。DHFR不僅與腫瘤細(xì)胞的繁殖和復(fù)制密切相關(guān)，而且在臨床在使用化療藥物時(shí)DHFR發(fā)生變化是導(dǎo)

4、致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)理之一，所以研究DHFR的活性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究采用親和毛細(xì)管電泳技術(shù)測(cè)定DHFR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，選用DHFR、FH2、NADPH作為反應(yīng)體系，通過(guò)調(diào)節(jié)電泳緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH值、添加的表面活性劑的濃度、運(yùn)行電壓及毛細(xì)管的溫度，優(yōu)化出實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)體系中各組分離的最適條件為含0.2％Brij-35的pH9.50的50 mmol/L硼砂緩沖溶液，分離電壓25kV，分離溫度25℃，進(jìn)樣壓力0.

5、5psi，進(jìn)樣時(shí)間10s，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，電流為174.3μA。結(jié)果表明親和毛細(xì)管電泳可以在30min內(nèi)實(shí)現(xiàn)DHFR反應(yīng)體系中反應(yīng)物和生成物的分離，觀察不同底物濃度下的電泳圖譜，利用反應(yīng)物或者生成物峰面積的變化來(lái)研究在酶反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)物或者生成物濃度的變化，計(jì)算出二氫葉酸還原酶的Km值為6.05×10-7mol/L.min，與其它文獻(xiàn)報(bào)道一致。親和毛細(xì)管電泳方法具有進(jìn)樣量少、操作簡(jiǎn)便、靈敏皮高、易于分離和定量、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，已被

6、廣泛地應(yīng)用于生物體內(nèi)酶活性的研究。 第二部分親和毛細(xì)管電泳法測(cè)定氨甲蝶呤對(duì)映體與二氫葉酸還原酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù) 氨甲蝶呤(MTX)是DHFR的強(qiáng)抑制劑，能與DHFR的活性部位發(fā)生可逆而牢固地結(jié)合，使該酶失活，它比葉酸對(duì)此酶的親和力大105倍，因此MTX的抗腫瘤作用強(qiáng)而持久，是常見的腫瘤化療藥物之一。自然界中的MTX為手性對(duì)映體，存在L和D兩種構(gòu)型，分別為L(zhǎng)-(+)-MTX和D-(-)-MTX，但這兩種對(duì)映體藥物的活性是否存

7、在差異，國(guó)內(nèi)外均未見相關(guān)報(bào)道。 本研究亦采用親和毛細(xì)管電泳技術(shù)，反應(yīng)體系選用DHFR、FH2、NADPH的混合物，毛細(xì)管優(yōu)化的分離條件同第一部分。將已知的L-(+)-MTx和D-(-)-MTX分別作用于所建立的DHFR體系，根據(jù)酶反應(yīng)生成物峰面積的變化測(cè)定兩種對(duì)映體的半數(shù)抑制濃度。觀察不同濃度的氨甲蝶呤對(duì)映體L-(+)-MTx和D-(-)-MTX對(duì)DHFR抑制的電泳圖譜，根據(jù)反應(yīng)生成物NADP+峰面積的變化計(jì)算得出D-(-)-M

8、TX的IC50為31.67×10-mol/L,L-(+)-MTX的IC50為2.48×10-8mol/L，兩者相差13倍左右，結(jié)果表明MTX兩種對(duì)映體對(duì)DHFR抑制差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本方法用于MTX對(duì)映體與DHFR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，每次反應(yīng)總體積僅為100μl，2ml的分離試劑，且在30min內(nèi)能準(zhǔn)確分離并定量反應(yīng)物和生成物，與其它傳統(tǒng)的方法以及高效液相色譜法相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 第三部分人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中二氫

9、葉酸還原酶的提取純化 用體外培養(yǎng)的人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞離心提取上清液，上樣于蛋白純化儀，運(yùn)用的是1.3cm×10cm DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，從肺癌A549細(xì)胞中提取純化得到DHFR。通過(guò)調(diào)節(jié)超聲破碎的功率、間隔時(shí)間、次數(shù)以及離子交換層析柱平衡緩沖液的pH、KC1洗脫濃度梯度、洗脫的速度，得出純化DHFR的最佳條件，收集洗脫的蛋白

10、峰，進(jìn)行12％SDS-PAGL垂直板電泳分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白來(lái)統(tǒng)計(jì)條帶的分子量。將含DHFR酶各管溶液冷凍真空干燥，-60℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩EAE-Sepharose Fast Flow利用離子交換和分子篩的原理，根據(jù)酶的等電點(diǎn)調(diào)節(jié)平衡緩沖液的pH值，以及控制流速充分利用其分離能力，可以用于細(xì)胞中DHFR的提取純化。 總結(jié)： 總之，親和毛細(xì)管電泳技術(shù)可以用于DHFR活性以及與MTX對(duì)映體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，首次檢測(cè)出M