2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:在世界范圍內(nèi),惡性腫瘤高居死亡原因的首位。我國情況亦類似,據(jù)流行病學(xué)調(diào)查表明,中國每年癌癥發(fā)病人數(shù)約312萬,死亡人數(shù)約270萬,近20年腫瘤的發(fā)病率和死亡率均呈逐漸上升趨勢,成為城市和農(nóng)村居民的第一位死因。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌是最常見的5種腫瘤殺手,嚴(yán)重威脅著人類健康。在腫瘤治療方面,常規(guī)的細胞毒性抗癌藥物的特異性低、毒副作用大,而靶向抗腫瘤藥物可針對腫瘤的發(fā)病機制抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,毒副作用小。因此尋找一個有效

2、的靶向藥物成為腫瘤研究的一項新課題。Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎的正常發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,而隨著個體的發(fā)育成熟,Hh信號通路逐漸失活。近年研究表明Hh信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。為了研究Hh信號通路異常激活的分子機制,我們采用酵母雙雜交的方法,以Hh信號通路負調(diào)控因子SuFu為誘餌蛋白,與文庫雜交,發(fā)現(xiàn)SuFu與二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)相互作用。DH

3、FR可以將體內(nèi)的二氫葉酸(FH2)還原為四氫葉酸(FH4),從而調(diào)節(jié)四氫葉酸的再生。DHFR的敲除和過表達影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。因此,研究DHFR在Hh信號通路中的作用對于深入了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要意義。
  目的:⑴通過酵母雙雜交與生化學(xué)方法研究DHFR與Hh信號通路的負性調(diào)控因子SuFu之間的相互作用關(guān)系。⑵研究DHFR對Hh信號通路關(guān)鍵因子SuFu、Gli1、Gli2和細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1的影響,以及

4、對腫瘤細胞凋亡的影響,探討DHFR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義。
  方法:①設(shè)計不同的DHFR引物,采用基因克隆的方法分別構(gòu)建pGADT7-DHFR、DHFR-pcDNA3.1/myc-his、pEGFP-DHFR、pcDNA3-FLAG-DHFR四種表達質(zhì)粒。②設(shè)計并構(gòu)建DHFR的干擾質(zhì)粒,檢測干擾質(zhì)粒的干擾效果。③采用酵母雙雜交和GST pull-down法檢測DHFR和SuFu之間是否存在相互作用。④蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測

5、GnRH神經(jīng)細胞系NLT和人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251、H4中DHFR、SuFu、Gli、Cyclin D1的蛋白質(zhì)水平以及DHFR抑制劑甲氨蝶呤(MTX)處理細胞前后和過表達DHFR或miRNAi敲低DHFR后的相關(guān)蛋白質(zhì)水平。⑤qRT-PCR法檢測MTX處理細胞前后及過表達DHFR或miRNAi敲低DHFR后Hh信號通路相關(guān)因子的mRNA水平。⑥利用Gli-luciferase表達質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,用不同濃度MTX處理細胞,

6、觀察對Gli轉(zhuǎn)錄活性的影響。⑦MTT法檢測不同濃度MTX處理細胞后的細胞存活率。
  結(jié)果:⑴成功構(gòu)建了DHFR的表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒;⑵酵母雙雜交實驗中,QDO/X/A平板上酵母能夠生長且菌落呈藍色,而對照組不能生長,證實了SuFu蛋白和DHFR蛋白存在相互作用; GST pull-down實驗中, SuFu蛋白能與DHFR蛋白相結(jié)合,而GST蛋白不能,表明了DHFR與SuFu在體外能夠相互作用;⑶相比GnRH神經(jīng)細胞系NLT,人

7、腦膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251、H4的DHFR、Gli1、Gli2蛋白表達較高,提示在人腦膠質(zhì)瘤細胞中,DHFR呈高表達,Hh信號通路活性增加;⑷miRNAi敲低DHFR后Gli1、Gli2的mRNA水平和蛋白水平降低,而SuFu升高;MTX抑制DHFR后Gli1、Gli2的mRNA水平和蛋白水平降低,而SuFu和DHFR不變;過表達DHFR后Gli1的mRNA水平和蛋白水平升高,而SuFu降低;提示DHFR正調(diào)控Hh信號通路活性;⑸用

8、MTX處理穩(wěn)定表達Luciferase-8GBS的293T細胞,熒光素酶活性報告實驗結(jié)果表明,隨著MTX濃度的增加,Gli轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降,提示DHFR正調(diào)控Hh信號通路活性;⑹用MTX分別處理H4細胞24h和48h,酶標(biāo)儀檢測各組別的吸光度值,結(jié)果顯示24 h組和48 h組的細胞生長抑制率隨著MTX濃度的增加呈逐漸上升趨勢,提示DHFR正調(diào)控Hh信號通路活性。
  結(jié)論:①DHFR與SuFu相互作用;②DHFR通過結(jié)合Hedge

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