穩(wěn)定表達(dá)人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1的細(xì)胞模型構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、本研究利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法在馬丁達(dá)比犬腎細(xì)胞(MDCK)中穩(wěn)定表達(dá)人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(hPEPT1)，在mRNA水平、轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性水平進(jìn)行了驗(yàn)證；并將該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型用于中藥單體hPEPT1潛在抑制劑/底物的篩選，發(fā)現(xiàn)多個(gè)對(duì)hPEPT1具有抑制作用的單體化合物。
　　 目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hPEPT1的MDCK細(xì)胞模型(MDCK-hPEPT1)，應(yīng)用該模型篩選中藥單體中hPEPT1潛在抑制劑/底物，為后續(xù)研究基于hPEPT1的藥物-藥物相互

2、作用，以及發(fā)現(xiàn)以hPEPT1為靶點(diǎn)的炎癥性腸病拮抗劑提供參考。
　　 方法：構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hPEPT1，將其轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后有限稀釋法挑選單克隆細(xì)胞，通過PEPT1經(jīng)典底物Glysar、β-Ala-Lys(AMCA)、Carnosine等驗(yàn)證單克隆細(xì)胞中hPEPT1轉(zhuǎn)運(yùn)活性，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)hPEPT1的mRNA表達(dá)情況，從中篩選出穩(wěn)定高表達(dá)hPEPT1的單克隆細(xì)胞

3、。將篩選出的活性好的單克隆細(xì)胞用于中藥單體中hPEPT1潛在配體的篩選，以中藥單體對(duì)Glysar攝取的抑制作用為表征，從中選出抑制作用較強(qiáng)的馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓，測(cè)定它們作用于Glysar攝取轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，同時(shí)利用Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)一步驗(yàn)證這三種化合物對(duì)Glysar攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用。
　　 結(jié)果：經(jīng)有限稀釋法獲得的單克隆細(xì)胞通過底物β-Ala-Lys(AMCA)和Glysar驗(yàn)證后，獲得兩株轉(zhuǎn)運(yùn)活性較好的單

4、克隆細(xì)胞，這兩株細(xì)胞中hPEPT1的mRNA表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的細(xì)胞；已知的hPEPT1抑制劑(底物)顯著減少單克隆細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取。將獲得的活性最好的單克隆細(xì)胞用于中藥單體篩選，發(fā)現(xiàn)部分中藥單體能較大程度程度抑制Glysar的攝取。其中，馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓對(duì)Glysar攝取的IC50分別為4.1μmol·L-1，22.4μmol·L-1，250.1μmol·L-1；上述三個(gè)化合物在單

5、克隆細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞中的攝取無差異；無抑制劑存在時(shí)，單克隆細(xì)胞攝取Glysar的Km和Vmax分別為0.75mmol·L-1、0.32 nmol·mg protein-1·min-1，在馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓存在時(shí)，Km和Vmax分別變?yōu)?.99 mmol·L-1、0.94 mmol·L-1、0.81 mmol·L-1和0.25nmol·mg protein-1·min-1、0.24 nmol·mg protein-1·m

6、in-1、0.18 nmol·mg protein-1·min-1。馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取Glysar呈現(xiàn)濃度依賴性抑制，三個(gè)化合物均能降低Glysar在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了MDCK-hPEPT1細(xì)胞模型，該模型能用于PEPT1底物及抑制劑的高通量篩選；利用該模型篩選獲得多種對(duì)hPEPT1具有一定抑制作用的中藥單體，其中，馬兜鈴酸A、新狼毒素B、水飛薊賓經(jīng)驗(yàn)