大腸埃希菌臨床分離株高產(chǎn)AmpC酶與基因介導(dǎo)、突變表達(dá)方式的研究.pdf

1、大腸埃希菌(E.coli)是引起尿路感染、呼吸道感染、傷口感染甚至全身感染的常見(jiàn)病原菌之一，它對(duì)三代頭孢菌素耐藥的主要原因是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBls)和AmpC 酶。ESBLs來(lái)自突變的廣譜β-內(nèi)酰胺酶(如TEM-1，TEM-2，SHV-1)，由質(zhì)粒攜帶能夠水解氨氧頭孢菌素和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物，可被克拉維酸(CA)抑制，最常見(jiàn)于E.coli和克雷伯菌屬，也見(jiàn)于其他腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍德菌等細(xì)菌。AmpC酶有

2、染色體介導(dǎo)和質(zhì)粒介導(dǎo)兩種基因攜帶狀態(tài)，質(zhì)粒介導(dǎo)的基因來(lái)源于染色體。AmpC酶能夠水解氨氧頭孢菌素、頭霉菌素和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類藥物，可被鄰氯西林(CLO)抑制，不能被CA等其他β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制。染色體編碼的ampC基因存在于大多數(shù)革蘭陰性桿菌的染色體上(克雷伯菌屬和奇異變形桿菌缺乏，沙門菌屬尚不確定)，呈誘導(dǎo)表達(dá)；質(zhì)粒編碼的ampC基因多為非誘導(dǎo)表達(dá)。 E.coli染色體上攜帶ampC基因，但其操縱子與其他細(xì)菌染色體的am

3、pC操縱子不同，因缺少調(diào)控基因ampR，呈低水平表達(dá)狀態(tài)，酶產(chǎn)量非常低，臨床意義不大。質(zhì)粒型ampC基因轉(zhuǎn)入或染色體上ampC基因啟動(dòng)或衰減序列突變，ampC結(jié)構(gòu)基因突變或擴(kuò)增，以及ampC調(diào)節(jié)基因的突變均能導(dǎo)致AmpC酶的高表達(dá)。質(zhì)粒型AmpC酶和染色體突變型AmpC酶的出現(xiàn)不僅使E.coli的耐藥性增強(qiáng)而且直接干擾了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)ESBLs的檢測(cè)，增加了臨床治療的難度。 本課題收集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室200

4、1年1月至2004年10月臨床各類標(biāo)本中分離的可疑同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs或單產(chǎn)AmpC酶的40株E.coli，采用一系列的方法對(duì)耐藥表型、高活性β-內(nèi)酰胺酶的類型和特點(diǎn)、ampC基因攜帶和突變表達(dá)方式、以及細(xì)菌外膜蛋白的改變進(jìn)行研究，并探討提高ESBLs檢出率和區(qū)別AmpC酶的、適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)方法。 在抗菌藥物敏感試驗(yàn)中，40株菌均呈多重耐藥，對(duì)頭孢三嗪(CRO)、頭孢噻肟(CTX)和頭孢他啶(CAZ)3種三代頭孢

5、菌素中的2種以上出現(xiàn)耐藥，對(duì)環(huán)丙沙本文運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞分析、激光共聚焦顯微鏡分析等免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)，綜合研究和觀察了hsBAFF對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞的免疫功能活性及其胞內(nèi)Ca<'2+>信號(hào)變化，T淋巴細(xì)胞亞群分布和NK細(xì)胞活性影響，探討了hsBAFF對(duì)機(jī)體特異性免疫細(xì)胞乃至整體免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用及其作用機(jī)制。結(jié)果如下： 1 hsBAFF注射小鼠體重和血液18項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)變化 選用48只健康ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分

6、為對(duì)照組和5個(gè)不同劑量的hsBAFF處理組，處理組分別每日腹腔注射含hsBAFF 0.01、0.1、0.5、l、2 mg／kg體重的PBS溶液，對(duì)照組注射同等劑量的PBS溶液。每天對(duì)各組小鼠稱重，分別在第4、8天測(cè)定小鼠血液18項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)。結(jié)果表明：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，小鼠體重均隨日齡而增加，各組問(wèn)無(wú)顯著差異；各組血液1 8項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)沒(méi)有顯著變化，只在第4天時(shí)個(gè)別指標(biāo)有波動(dòng)，但均在生理正常允許范圍內(nèi)。提示：hsBAFF對(duì)小鼠的正常生理指標(biāo)無(wú)

7、明顯影響，表明其對(duì)機(jī)體沒(méi)有明顯的毒害作用，為hsBAFF進(jìn)入臨床階段的研究提供了毒理學(xué)證據(jù)。 2 hsBAFF注射小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞活性和血漿IgM、IgA、IgG含量變化研究 選用40只健康ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)不同劑量的hsBAFF處理組，每組10只。處理組每日腹腔注射含hsBAFF 0.1、0.5和1mg／kg體重的PBS溶液，對(duì)照組注射同等劑量的PBS溶液。分別在第4、8天檢測(cè)脾臟B淋

8、巴細(xì)胞的增殖活性和對(duì)12S免疫反應(yīng)以及血清IgM、IgA、IgG的含量變化。結(jié)果表明：1asBAFF注射組小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的自然增殖活性顯著升高并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)第8天B淋巴細(xì)胞對(duì)L,PS的刺激增殖活性明顯上升；注射第4、8天時(shí)，hsBAFF注射組小鼠血清IgM含量升高近兩倍，IgA含量也有顯著升高。血清IgG含量在實(shí)驗(yàn)第4天與對(duì)照組相當(dāng)，但第8天時(shí)O.5-1.0 mg／kghsBAFF注射組明顯高于對(duì)照組。提示：hsBAFF可

9、以通過(guò)提高B淋巴細(xì)胞的增殖活性和免疫反應(yīng)及增加血清IgM，IgA和IgG的含量增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。 3 hsBAFF注射對(duì)小鼠脾臟cD<'4+>和CD8<'+>T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞活性調(diào)節(jié)作用研究 選用40只健康ICR小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)hsBAFF處理組，每組8只。HsBAFF處理組分別每日腹腔注射hsBAFF(0.01、O.1、0.5和2 mg／kg體重)的PBS溶液，對(duì)照組注射同等劑量的PB