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文檔簡介
1、本研究用已構(gòu)建的表達(dá)禽(番鴨)呼腸孤病毒s3和S4 ORF2基因的原核表達(dá)載體pET-30a/S3、pET-30a/S4 ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑取陽性克隆培養(yǎng),IPTG誘導(dǎo)后裂解菌體作SDS-PAGE,分別出現(xiàn)大小約36KD和43KD的表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)Western-blot驗證重組蛋白具有DRV抗原性,通過摸索不同誘導(dǎo)時間、不同誘導(dǎo)所需IPTG濃度、不同誘導(dǎo)溫度優(yōu)化了σ3和σC蛋白的表達(dá)條件:對σB,用終濃度為0.5mM的IPT
2、G誘導(dǎo),于37℃振蕩培養(yǎng)5h;對σC用終濃度為0.8-1.0mM的IPTG誘導(dǎo),于37℃振蕩培養(yǎng)3h。融合蛋白以包涵體的形式存在,分別采用螯合親和層析和尿素洗滌純化了包涵體中的融合蛋白。 利用純化的DRV重組σC蛋白作為抗原致敏乳膠,并優(yōu)化了致敏乳膠的最佳濃度,溫度和時間,初步建立了檢測DRV抗體的乳膠凝集試驗(LAT)。試驗結(jié)果表明,抗體致敏乳膠敏感性高,特異性強,穩(wěn)定性好。σ用1日齡雛番鴨免疫評價了禽(番鴨)呼腸孤病毒衣殼蛋
3、白GB和σC亞單位疫苗在番鴨體內(nèi)的免疫原性。接種σB,σC和σB+σC重組亞單位疫苗的番鴨用相同病毒攻毒后分別出現(xiàn)50%,40%和30%的死亡率,陽性對照組番鴨攻毒后出現(xiàn)70%的死亡率。 根據(jù)本實驗室測得的禽(番鴨)呼腸孤病毒YB株S3和S4 ORF2基因序列,采用SOPMA法、Gamier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schultz法方法預(yù)測了其結(jié)構(gòu)蛋白的二級結(jié)構(gòu),用Hopp-Wroods方法對結(jié)
4、構(gòu)蛋白的親水性進(jìn)行了分析,用Emini方法預(yù)測了σB和σC蛋白的表面可能性,以Jameson-wolf和吳玉章等建立的方法預(yù)測了蛋白的抗原指數(shù),然后綜合分析σB和σC蛋白的B細(xì)胞抗原表位。結(jié)果顯示σB蛋白B細(xì)胞表位可能在136~150、157~167及240~249區(qū)域或其附近,σC蛋白B細(xì)胞表位可能15~27、36~49、40~49及90~98區(qū)域或其附近,在這幾被預(yù)測的表位均含有β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。本研究為實驗確定σB和σC蛋白
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