Aβ-,1-15-多重抗原肽疫苗合成工藝及其免疫原性的研究.pdf

1、Aβ1-15多重抗原肽疫苗合成工藝及其免疫原性的研究專業(yè)人體解剖與組織胚胎學(xué)研究方向老年癡呆疫苗的研究與開發(fā)博士后楊學(xué)森合作導(dǎo)師姚志彬教授中炬高新技術(shù)實(shí)業(yè)股份有限公司博士后工作站中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室摘要目的阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是一種最常見好發(fā)于老年人的神經(jīng)退行性疾病，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(βamyloidpeptide，Aβ)在AD發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，由此近年來興起了針對(duì)

2、Aβ為靶，采用主動(dòng)免疫對(duì)AD進(jìn)行預(yù)防和治療的研究。不僅實(shí)驗(yàn)室研究證明采用Aβ42全肽免疫能夠清除或抑制AD轉(zhuǎn)基因模型鼠腦內(nèi)的Aβ沉積，明顯改善其認(rèn)知功能，具有明確治療作用，而且Elan公司還研制開發(fā)出一種AD疫苗(AN1792)，并進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)。但在Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中由于有6％的接種病人出現(xiàn)了非感染性腦膜腦炎，實(shí)驗(yàn)被終止。隨后對(duì)出現(xiàn)不良反應(yīng)的原因進(jìn)行一系列研究和探討，認(rèn)為AN1792中采用的Aβ42全長(zhǎng)肽段含有T細(xì)胞表位，能夠刺激AD病人

3、體內(nèi)T細(xì)胞過度反應(yīng)，從而出現(xiàn)T細(xì)胞浸潤(rùn)性腦炎。因此，課題組選取只含有B細(xì)胞表位的Aβ1-15片段作為免疫原，采用多重抗原肽技術(shù)(multipleantigenspeptide，MAPs)，設(shè)計(jì)了八分支MAPAβ1-15，與免疫佐劑MF59一起組成AD疫苗，并申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)朇N03114042.4)。并在大鼠、猴、轉(zhuǎn)基因Tg2576鼠幾種動(dòng)物模型上驗(yàn)證其具有很好的有效性和安全性。本研究在此基礎(chǔ)上，根據(jù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)這一新型AD疫苗的要求，采

4、用不同的方法，摸索實(shí)驗(yàn)室合成MAPAβ1-15的技術(shù)路線和具體參數(shù)，觀察所合成的MAPAβ1-15免疫原性，為以后能夠研制開發(fā)出可實(shí)際應(yīng)用于臨床的AD疫苗打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 方法：分別采用直接合成法和間接偶聯(lián)法兩種策略，以Fmoc固相多肽合成法和蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)合成MAPAβ1-15，采用RP-HPLC對(duì)合成的MAPAβ1-15進(jìn)行分離純化。對(duì)兩種方法合成的MAPAβ1-15應(yīng)用RP-HPLC檢測(cè)其純度，應(yīng)用SDA-PAGE凝膠電泳

5、初步鑒定其組份和相對(duì)分子量范圍，應(yīng)用激光電子飛行質(zhì)譜儀(MALDI-ToF)測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量，應(yīng)用氨基酸分析儀分析合成MAP的氨基酸組成及含量。以兩種方法合成的MAPAβ1-15配伍免疫佐劑MF59，分別免疫C57BL/6小鼠，ELISA檢測(cè)血清特異性抗Aβ抗體。 結(jié)果：Fmoc法直接合成的MAPAβ1-15，凝膠電泳結(jié)果顯示小于18KD處有一條比較粗大的電泳條帶，在小于9KD處有一條淺細(xì)的拖尾條帶。質(zhì)譜檢測(cè)顯示主要離子峰的相

6、對(duì)分子質(zhì)量為15458，與理論相對(duì)分子質(zhì)量15451十分接近，主峰跨度接近5000，還存在其它不同分子質(zhì)量的離子峰。 間接偶聯(lián)法合成的MAPcysAβ1-15，凝膠電泳結(jié)果顯示約8條電泳條帶，電泳條帶之間間隔均勻，分子量最大的一條帶約為17KD-16KD，分子量最小的一條帶小于4KD。質(zhì)譜檢測(cè)顯示很多不同相對(duì)分子質(zhì)量成份的離子峰存在，其中有八個(gè)主要離子峰的相對(duì)分子量與1-8分支MAPAβ1-15的理論分子量接近。氨基酸成份分析顯

7、示與合成的MAPcysAβ1-15的氨基酸組成一致，氨基酸含量除賴氨酸的結(jié)果偏高，其它基本與理論值相當(dāng)。 以兩種方法合成的MAPAβ1-15免疫C57BL/6小鼠后，均可在第二次免疫接種后開始產(chǎn)生特異性抗Aβ抗體，并隨著接種次數(shù)的增加抗體滴度不斷增高，在第五次接種后直接合成法實(shí)驗(yàn)組平均抗體滴度為1：4367±1120，間接偶聯(lián)法實(shí)驗(yàn)組平均抗體滴度為1：2267±1063。直接合成法實(shí)驗(yàn)組平均抗體滴度明顯高于間接偶聯(lián)法實(shí)驗(yàn)組(P＜

8、0.01)。 結(jié)論：1.直接合成法能夠成功合成出8分支MAPAβ1-15，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生很多相對(duì)分子量相差不大的雜肽，利用RP-HPLC難以進(jìn)行有效分離純化。 2.間接偶聯(lián)法合成出的MAPAβ1-15產(chǎn)物，是包含1-8條分支MAP的混合物，主要成份以1-4分支MAP為主，利用RP-HPLC難以將8分支的MAPAβ1-15分離純化出來。 3.兩種方法合成的MAPAβ1-15都能誘導(dǎo)接種的C57BL/6小鼠產(chǎn)生高滴度的