牛羊大腸桿菌K99-STⅠ雙價(jià)保護(hù)性抗原基因工程菌株的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、論述了包涵體粗提物蜂腔疫苗、工程菌全菌體蜂膠苗、工程菌全菌體滅活苗的構(gòu)建及免疫原性實(shí)驗(yàn)，全文主要內(nèi)容如下： 1．采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出0.54kb的K99(F5)菌毛抗原基因，將其克隆到pUCm-T載體上，酶切鑒定成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCm-K99；人工合成的、耐熱腸毒素ST I基因片段和重組質(zhì)粒,PUCm--K99，經(jīng)酶切(BamH I+Sal I)、回收、連接，將ST I基因片段插入K99菌毛抗原基因的下游，經(jīng)酶切和PCR方法

2、鑒定，獲得陽性重組質(zhì)粒pUCm-K99-ST，經(jīng)過測序分初證明完成K99-ST融合基因的構(gòu)建。 2．重組質(zhì)粒pUCm-K99-ST經(jīng)EcoR I+Sa/I消化，獲得K99-ST基因片段。將該片段分別插人表達(dá)載體．pGEX-4T-1及pET-30a中，篩選陽性重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-K99-ST和pET-K99-ST。將重組質(zhì)粒pGEX-K99-ST和pET-K99-ST分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，摸索最洼誘導(dǎo)條件(

3、37℃，IPTG0.4mM/l，220r/min誘導(dǎo)4h)，SDS電泳分析，pGEX-K99-ST表達(dá)童相對較低，約為10％左右；而pET-K99-ST表達(dá)量較高約為25％以上；融合蛋白經(jīng)回收、復(fù)性處理后，瓊擴(kuò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，K99-ST融合基因在工程菌BL21中獲得表達(dá)，并具有與K99抗體結(jié)合的活性。 3．通過反向間接血凝技術(shù)，檢測融合蛋白復(fù)性后的抗原滴度可以達(dá)到1：40。純化融合蛋白后，使用弗氏佐劑對其進(jìn)行包裹并免疫家兔(1d

4、，14d，21d)，免疫劑量(抗原滴度是1：40為0.5mL/只，Western-blot證實(shí)融畬蛋白具有良好的免疫原性。根據(jù)專利ZL8910687 6配制相應(yīng)疫苗(包涵體粗提物蜂腔疫苗、工程菌全菌體蜂膠苗、工程菌全菌體滅活苗)，使用小白鼠進(jìn)行安全性試驗(yàn)和動物攻擊試驗(yàn)，試驗(yàn)證實(shí)安全性良好，保護(hù)率較高。上述三種疫苗免疫家兔后采集抗血清，與處理后的強(qiáng)毒株上清溫育時(shí)1-3日齡的乳鼠進(jìn)行毒素中和試驗(yàn)，試驗(yàn)證實(shí)抗血清足以中和強(qiáng)毒株的STI腸毒素。