禽多殺性巴氏桿菌C48-3株外膜蛋白H的致病性及其受體的鑒定.pdf

1、禽霍亂是血清型A巴氏桿菌引起的一種接觸性傳染病，其發(fā)病率和死亡率很高，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本課題組前期研究結(jié)果表明，血清型A巴氏桿菌ompH基因的突變株對(duì)小鼠的致病性相對(duì)減弱，表明OmpH具有致病作用，但其致病機(jī)理尚未清楚。因此，本論文對(duì)OmpH的致病性進(jìn)行了以下研究工作：
　　用PCR從禽巴氏桿菌C48-3株基因組中擴(kuò)增出OmpH的編碼基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pQE-30的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組載

2、體pQE-ompH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，通過(guò)菌落PCR初選重組菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，親和層析法純化N端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白OmpH并制備其抗體。粘附試驗(yàn)比較野生株C48-3、突變株?ompH和互補(bǔ)株C48-3C對(duì)CEF細(xì)胞的粘附作用，而粘附抑制試驗(yàn)和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)OmpH的粘附作用。血清敏感性試驗(yàn)比較野生株、突變株和互補(bǔ)株對(duì)雞血清補(bǔ)體殺菌作用的抵抗力，吞噬試驗(yàn)比較小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)野生株、突變株和互補(bǔ)株的吞噬作用，

3、并檢測(cè)抗OmpH抗體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。用OmpH和其抗體經(jīng)配體印跡檢測(cè)CEF細(xì)胞膜蛋白中的OmpH受體，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定OmpH受體，免疫熒光染色檢測(cè)該受體在雞、兔、豬和牛食管粘膜細(xì)胞中的分布差異。
　　酶切鑒定和DNA測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)載體pQE-ompH構(gòu)建成功，SDS-PAGE結(jié)果顯示目的蛋白以不可溶性形式表達(dá)在大腸桿菌M15的細(xì)胞周質(zhì)中，用Ni2+親和層析柱從尿素變性后的沉淀中純化得到重組蛋白OmpH，

4、Western印跡結(jié)果顯示抗OmpH抗體分別能與重組OmpH和天然OmpH發(fā)生特性反應(yīng)。與野生株和互補(bǔ)株相比突變株對(duì)CEF細(xì)胞的粘附能力顯著降低，而抗OmpH抗體抑制野生株和互補(bǔ)株對(duì)CEF細(xì)胞的粘附，但該抗體不影響突變株的粘附能力。野生株和互補(bǔ)株在雞血清中的存活率顯著高于突變株，但滅活雞血清處理不影響它們的存活率。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)突變株的吞噬能力顯著高于野生株和互補(bǔ)株，而抗OmpH抗體增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)野生株和互補(bǔ)株的吞噬能力，但該抗體不