棉花草甘膦自然抗性評價及抗性基因源挖掘研究.pdf

1、自1940年第一例除草劑2，4-D問世至今，不斷出現(xiàn)各種作用機制的除草劑，目前種類繁多。1974年商業(yè)化的草甘膦具有廣諾、滅生性，殺草能力強，副作用小，在除草劑中獨樹一幟，且在全世界范圍內(nèi)被廣泛使用。發(fā)展轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物很大程度上方便了草甘膦除草，但存在轉(zhuǎn)基因安全隱患。因此，在植棉過程中，從現(xiàn)有棉花資源挖掘內(nèi)源抗草甘膦基因源，并用于棉花育種，可有效解決諸多問題。棉花種質(zhì)資源蘊含許多優(yōu)異基因，鑒于此，本文旨在對野生棉、半野生棉和亞洲棉種

2、質(zhì)材料草甘膦自然抗性進行鑒定和評價，分析半野生棉極端反應(yīng)材料的epsps基因序列及其表達量，闡明抗性與epsps基因的關(guān)系，并通過全基因組關(guān)聯(lián)分析方法，從數(shù)量性狀思路挖掘棉花中抗草甘膦的基因源。研究結(jié)果如下:
　　1.棉花種質(zhì)材料草甘膦自然抗性評價及比較分析
　　分別采用嫩枝噴灑法和棉花葉片棉球定位法，對26個野生棉種共134株和7個半野生棉種系共403份，及收集自5個地區(qū)的亞洲棉共101份材料，進行了草甘膦自然抗性的鑒定和

3、評價，并對其抗性水平進行了比較分析。通過田間鑒定試驗，獲得了一個棉花除草劑自然抗性鑒定的方法，擬定了相應(yīng)抗性水平的評價參考標準，并分別篩選出1份、2份和5份高抗的野生棉、半野生棉和亞洲棉材料，16份和1份高感的野生棉和半野生棉材料。分別以苗期、蕾期和花鈴期常規(guī)栽培棉中棉所12的草甘膦致死濃度0.1％、0.15％和0.25％為標準，采用噴灑法對高抗和高感半野生棉材料進行田間抗性鑒定，最終得到穩(wěn)定的抗和敏感材料各1份。同時，比較分析發(fā)現(xiàn)鑒定

4、材料抗性水平多樣性依次是:野生棉＞半野生棉＞亞洲棉;鑒定材料的整體抗性水平依次是:亞洲棉＞半野生棉＞野生棉。對棉花種質(zhì)資源的草甘膦抗性進行評價，有助于全面系統(tǒng)地了解棉花的草甘膦抗性，為研究棉花的草甘膦抗性機制及內(nèi)源抗性基因源的挖掘奠定材料基礎(chǔ)，同時也指導(dǎo)抗草甘膦棉花育種。
　　2.半野生棉內(nèi)源epsps基因序列及表達量分析
　　以sad1基因為參考基因，采用孟山都公司轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的基因序列特異引物，對半野生棉極端材料進

5、行轉(zhuǎn)基因成分檢測，證明篩選出的極端材料不舍轉(zhuǎn)抗草甘膦基因成分。采用陸地棉（珂字棉312）中epsps基因全長引物對半野生棉材料DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序并翻譯成氨基酸序列，比對分析發(fā)現(xiàn)半野生棉epsps基因沒有特異的氨基酸突變位點，說明半野生棉材料抗性的產(chǎn)生不是由epsps基因突變而致。對材料噴施0.2％的草甘膦溶液，48 h后取樣，采用RT-PCR方法檢測epsps基因表達量變化，發(fā)現(xiàn)革甘膦處理后，epsps基因表達量無明顯變化，

6、這表明半野生棉草甘膦抗性可能不是由epsps基因引起，而是其它抗性機制而致，有待以新的思路去研究。
　　3.關(guān)聯(lián)分析方法挖掘半野生棉草甘膦抗性基因源
　　2013年，在三個不同環(huán)境下，對202份半野生棉材料進行與草甘膦抗性相關(guān)表型的測定，包括莽草酸含量和地上部分相對干重，并與覆蓋全基因組的182對SSR多態(tài)性標記的基因型數(shù)據(jù)進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到72個與草甘膦抗性相關(guān)的位點，其中，48個和41個位點分別與莽草酸含量和

7、地上部分相對干重顯著相關(guān)?；诔晒﹃P(guān)聯(lián)的SSR引物序列和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所公布的雷蒙德氏棉(G.raimondii)、亞洲棉(G.arboreum L)和陸地棉（G.hirsutum）全基因組測序數(shù)據(jù)，共得到87條候選基因，包括亞洲棉中的21條，雷蒙德氏棉中的24條和陸地棉中的42條。以可可（Theobroma cacao）為模式植物，將這些基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進行注釋，探索相關(guān)的代謝通路，其中，ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族可能與草甘膦抗