辣椒疫病抗性基因QTL定位及挖掘.pdf

1、辣椒是世界五大蔬菜之一，可用作蔬菜、調(diào)料、色素、藥用等用途。它的種植面積十分廣泛，僅次于大白菜居第二位，但其產(chǎn)值卻居第一位。辣椒原產(chǎn)中南美洲，主要有五大栽培種。其中C.annuum是最為重要的一個栽培種種，它能同時在熱帶和溫帶地區(qū)生長，而且具有多樣化的特性。相比而言，其余四大種則只能在特定的環(huán)境下生長或只能在熱帶地區(qū)生長，并且大多用來做調(diào)料。辣椒疫病Phytophthora capsici.L）是世界性病害，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。本

2、試驗以辣椒高抗疫病材料PI201234和高感疫病材料G29及其構(gòu)建的F2群體為研究試材，采用前人篩選的EST-SSR引物，使用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合F2群體的抗疫病生物學(xué)鑒定，對辣椒抗疫病性進(jìn)行相關(guān)QTL定位，同時還對F2構(gòu)建的抗、感基因池進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。主要結(jié)論如下:
　　1.辣椒抗疫病鑒定
　　本試驗采用游動孢子灌根法進(jìn)行辣椒抗疫病鑒定。病原菌為江蘇淮安地區(qū)分離株，屬于生理小種Ph1。在PDA上

3、活化后轉(zhuǎn)入V8培養(yǎng)基，28℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7d后，長日照培養(yǎng)2～3 d以誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子囊，然后加入無菌水，4℃放置40 min后室溫30 min釋放游動孢子，制備濃度為1×104個/mL的孢子懸浮液。以辣椒高抗疫病材料PI201234和高感疫病材料G29為親本構(gòu)建F2群體，在6～8葉期進(jìn)行游動孢子灌根接種，每株20 mL，塑料薄膜保濕24 h后轉(zhuǎn)移至人工氣候箱，在溫度28℃，相對濕度90％，光照4000lx，12 h/d的條件下培養(yǎng)促

4、使發(fā)病。接種15d后統(tǒng)計結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)辣椒發(fā)病趨勢呈現(xiàn)偏正態(tài)分布，其中0級辣椒10株，1級辣椒16株，2級辣椒30株，3級辣椒33株，4級辣椒31株，5級辣椒28株。
　　2.辣椒抗疫病遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建
　　以抗疫病材料PI201234和感疫病材料G29構(gòu)建的F2群體為作圖群體，利用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。首先利用抗、感親本對664對EST-SSR引物組合進(jìn)行篩選，共獲得了具有多態(tài)性的引物114對，再經(jīng)過F

5、2部分單株驗證，選取65對多態(tài)性穩(wěn)定、條帶清晰的引物組合對F2進(jìn)行基因分型。應(yīng)用JoinMap4.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，以LOD值≥2作為閾值，利用“Kosambi”作圖函數(shù)，構(gòu)建了一張包含10個連鎖群，49個EST-SSR標(biāo)記的辣椒遺傳連鎖圖譜。連鎖群總長度為418.6 cM，平均每個連鎖群上標(biāo)記數(shù)在2～12個之間，兩標(biāo)記間的平均遺傳距離為8.55 cM。
　　3.辣椒抗疫病相關(guān)QTL定位
　　運用MapQTL4.0軟件的

6、復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL分析。在構(gòu)建的辣椒遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)上結(jié)合抗疫病生物學(xué)鑒定，在N3連鎖群上檢測到1個QTL位點，該QTL位點LOD值為2.45，在連鎖群上的支持區(qū)域是0～5.0 cM，距離最近的標(biāo)記ESTSSR451是5.0 cM，可解釋表型差異的貢獻(xiàn)率為14.9％。
　　4.辣椒轉(zhuǎn)錄組測序分析
　　辣椒總RNA純化得到mRNA，打斷mRNA反轉(zhuǎn)錄成不同片斷大小的DNA，用IIumina HiseqTM2000進(jìn)行測

7、序。再利用原始reads（雙端序列）組裝該物種的UnigeneLibrary(Unigene庫)，基于Unigene庫進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋、基因表達(dá)分析、基因功能注釋等。測序共獲得44.6 Gb數(shù)據(jù)量，其中reads數(shù)220，810，807條，CycleQ20達(dá)到100％。Unigene中有77，333條，基因表達(dá)注釋分析中，93，307條Unigene注釋到NR數(shù)據(jù)庫;86，638條注釋到NT數(shù)據(jù)庫;55，955條釋到Swiss-Prot