新型高抗草甘膦EPSPS基因的克隆及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性位點鑒定.pdf

1、莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)(EC2.5.1.19)]是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草劑草甘膦是PEP的結(jié)構(gòu)類似物，能與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合

2、成，最終導(dǎo)致植物死亡。有些微生物來源的EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，這一途徑是生物產(chǎn)生草甘膦抗性的被動方式；另一方面，最新研究發(fā)?，F(xiàn)，草甘膦能被草甘膦 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glyphosate N-acetyltransferase，GAT)乙酰化，乙酰化的草甘膦失去與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，這是宿主生物獲得草甘膦耐受的主動方式。 草甘膦的廣泛使用及其非選擇性的特點，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作

3、物成為研究熱點。但迄今為止，成功用于商業(yè)化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因只有CP4-EPSPS基因，許多本身無抗性或抗性不高的EPSPS基因，通過突變其氨基酸而降低與草甘膦之間親和性來產(chǎn)生草甘膦抗性的同時，也降低了與PEP之間的親和性，使酶活性不足，難以應(yīng)付反應(yīng)所需；另一方面，利用N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的草甘膦耐受機制培育的新抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物還未見問世。如今，改造草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，提高其抗性，培育新基因型抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物及結(jié)合高抗EPSPS

4、培育雙價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物成為新的研究方向。我國作為草甘膦生產(chǎn)和出口的大國，目前尚沒有具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、適用于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的EPSPS基因，在國際競爭中處于不利地位；而對草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的研究還處于起步階段。因此，尋找具自主知識產(chǎn)權(quán)的高抗草甘膦EPSPS新基因、開展對草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性位點的研究，對尋找抗草甘膦新基因中的專利保護位點以及改造、利用新基因培育新型抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物均具有積極意義。 本論文就當(dāng)前我國

5、抗除草劑作物基因工程中存在的“草甘膦抗性功能基因缺乏”這一主要問題，針對抗草甘膦的被動和主動機制，開展了對EPSPS和GAT的研究。充分利用我國極端污染環(huán)境微生物基因資源的生物多樣性，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了草甘膦極端污染土壤的宏基因組文庫，通過對大腸桿菌aroA突變株的功能互補對文庫進行了篩選；并通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)，對部分活性位點作了分析鑒定，主要的研究成果如下： 1、構(gòu)建了大腸桿菌aro

6、A基因的插入突變株 對突變株進行功能互補、通過突變株某一性狀的恢復(fù)來篩選基因是一種直接、巧妙、高效的方法，現(xiàn)已有諸多利用大腸桿菌突變株的功能互補來獲得目的克隆的報道。大腸桿菌的EPSPS由aroA基因編碼，當(dāng)aroA基因突變后，大腸桿菌的莽草酸途徑被阻斷，不能合成大腸桿菌生存所必需的芳香族氨基酸，使大腸桿菌喪失了在限制性培養(yǎng)基中生長的能力。但當(dāng)向該突變株中轉(zhuǎn)入EPSPS的編碼基因后，它能恢復(fù)在限制性培養(yǎng)基中的生長能力。因此，大腸

7、桿菌aroA基因突變株結(jié)合限制性培養(yǎng)篩選基是EPSPS基因的高效篩選平臺，構(gòu)建大腸桿菌aroA突變株是克隆草甘膦抗性EPSPS基因的一個重要環(huán)節(jié)。 傳統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌突變株的方法是依賴大腸桿菌自身Rec A和Rec BCD組成的Rec A重組系統(tǒng)，但此系統(tǒng)有較大的不足之處：Rec BCD具有核酸外切酶V活性，會降解線性DNA分子，所以必須構(gòu)建環(huán)形的具有靶位點的打靶質(zhì)粒才能不被分解；另外，Rec A重組幾率很低，很難獲得所需的重組子

8、。 本研究首先構(gòu)建了中間帶有卡那霉素抗性篩選標(biāo)記、兩側(cè)片段與aroA基因同源的線性DNA片段AK(AK兩側(cè)與aroa的同源部分長度>500bp)及中間帶有氯霉素篩選標(biāo)記、兩側(cè)片段與aroA基因同源的線性DNA片段AC(兩側(cè)與aroA的同源臂為40bp)，將它們電擊轉(zhuǎn)化入含有輔助質(zhì)粒pKD46、能表達(dá)λ噬菌體Red重組系統(tǒng)的大腸桿菌BW25113中。Red重組系統(tǒng)能實現(xiàn)直接利用線性DNA轉(zhuǎn)化來構(gòu)建大腸桿菌突變株，并且重組效率高。在

9、該系統(tǒng)的介導(dǎo)下，帶長同源臂的DNA片段AK與大腸桿菌基因組發(fā)生同源雙交換，獲得了卡那霉素抗性基因插入的aroA基因突變株AKM4188。AKM4188不能在限制性培養(yǎng)基中生長。但當(dāng)轉(zhuǎn)入自身EPSPS或HGT7 EPSPS的編碼基因后，它能恢復(fù)在限制性培養(yǎng)基中的生長能力。AKM4188的構(gòu)建，為新草甘膦抗性EPSPS基因篩選奠定了重要基礎(chǔ)。 2、建立草甘膦極端污染土壤的宏基因組文庫及高抗草甘膦EPSPS新基因的克隆 土壤微

10、生物中蘊藏著巨大的基因資源，但利用現(xiàn)在的培養(yǎng)技術(shù)可培養(yǎng)的微生物只占其總量的1％以下，因此人們對這一資源寶庫的了解和利用還十分有限。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和微生物學(xué)研究手段的進步，宏基因組(metagenomics)技術(shù)應(yīng)運而生。宏基因組技術(shù)能直接從環(huán)境樣品中提取總DNA，構(gòu)建總DNA文庫，通過功能分析或序列分析來篩選目的基因。這一技術(shù)為我們研究目前尚不可培養(yǎng)的微生物、開發(fā)新的基因資源提供了可能。據(jù)報道，通過功能篩選宏基因組的方法已經(jīng)獲

11、得了許多新的和已知抗生素的抗性基因，脂酶、幾丁質(zhì)酶、膜蛋白及代謝4-羥基丁酸的酶編碼基因，以及一些編碼生物素合成途徑的酶基因等。在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)應(yīng)用上潛力巨大。 本研究從草甘膦極端污染土壤中直接分離、提取細(xì)菌總DNA，經(jīng).9au3A I酶切成2至6kb的片段后，將其連入經(jīng)BamH I酶切、并去磷酸化的pACYC184質(zhì)粒。所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AKM4188后獲得約5，000個克隆的土壤宏基因組文庫。將這些克隆在含有草甘膦的限制性

12、培養(yǎng)基上篩選，從中分離得到能抗草甘膦近200mM的EPSPS新基因RD aroA。選擇部分Class Ⅰ型和Class Ⅱ型EPSP合酶氨基酸序列與本研究所獲得的RD EPSPS在http://www.ebi.ac.uk/selvices網(wǎng)上用T-Coffee進行多基因序列比對表明RD EPSPS與Ⅰ型EPSPS氨基酸的identity值低于30％；而與Ⅱ型的EPSPS氨基酸的identity值高于50％，該結(jié)果說明RD EPSPS屬于

13、Ⅱ型EPSPS。比對結(jié)果還顯示RD EPSPS也具有與草甘膦抗性相關(guān)和維持PEP綁定相關(guān)的重要區(qū)域。將RD aroA在大腸桿菌中表達(dá)、對其表達(dá)產(chǎn)物的酶動力學(xué)研究表明，RD EPSPS不僅具有高的草甘膦抗性(200mM)，Ki(glyphosate)為121μM，而且具有較高的PEP親和性[Km(PEP)：34μM]，提示該基因有望成為培育高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因材料。 3、草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性位點的鑒定 草甘膦被植

14、物吸收后會殘留在植物中，并在其分生組織中積累，植物的生長發(fā)育因此受到影響，從而降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量。草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)為解決這一問題提供了可能。草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能將草甘膦乙?；梢阴２莞熟⒍怪舛尽⑹コ輨┗钚?。草甘膦乙酰化解毒可以避免草甘膦在植物體內(nèi)的積累，使得草甘膦在作物的整個生長周期都可應(yīng)用，不受生長發(fā)育階段的限制，同時也能耐受更高的草甘膦濃度。這一發(fā)現(xiàn)揭示了新的草甘膦耐受機制，為培育草甘膦耐受農(nóng)作物提供了另一可選

15、的模式。 雖然草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)已報道，但其抗性相關(guān)的保守區(qū)域及活性位點還尚不清楚。揭示該蛋白的活性位點，對在抗草甘膦新基因中尋找新的專利保護位點和高效特異的抑制劑以及改造、利用該基因均具有一定的指導(dǎo)意義。 本研究通過利用Rate4Site這一生物學(xué)軟件，根據(jù)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族進化和拓?fù)鋵W(xué)的關(guān)系，預(yù)測了草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)。從保守區(qū)及非保守區(qū)各選取3個位點進行定點突變，分別檢測了突變體的草甘膦抗性，并

16、將各突變體在大腸桿菌中表達(dá)，突變體蛋白純化后進行了圓二色譜(CD)及熒光光譜檢測。以上實驗結(jié)果證明，在預(yù)測保守區(qū)的位點P<'134>(MTGAT1)、S<'52>(MTGAT13—2)、I<'53>(MTGAT87)發(fā)生突變后，GAT草甘膦的抗性幾乎喪失，并且其相應(yīng)的CD譜線和熒光譜線也較野生型發(fā)生了較大變化；而在非保守區(qū)的位點突變后，其草甘膦抗性及相應(yīng)的譜線并沒有發(fā)生變化。這些實驗結(jié)果與生物信息學(xué)軟件預(yù)測的結(jié)果基本一致。這一結(jié)果也提示