來(lái)源于澳大利亞鏈球菌的高抗草甘膦aroA基因的克隆及酶學(xué)特性研究.pdf

1、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase)(EC2.5.1.19)是莽草酸途徑（參與合成芳香族氨基酸的主要途徑）第六步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化莽草酸-3-磷酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成無(wú)機(jī)磷和5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)。該酶是植物和微生物的芳香族氨基酸合成必不可

2、少的酶。草甘膦作為一種目前世界上應(yīng)用最普遍的廣譜、非選擇性除草劑是該酶的抑制劑，它競(jìng)爭(zhēng)取代PEP和酶、S3P形成三聚體結(jié)構(gòu)（AroA-S3P-草甘膦）。然而，草甘膦是廣譜滅生性除草劑對(duì)農(nóng)作物也有影響。所以，為促進(jìn)草甘膦工業(yè)的發(fā)展和降低農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)成本和提高生產(chǎn)效率，對(duì)具有草甘膦耐受性或能降解草甘膦農(nóng)作物的研發(fā)與推廣顯得尤為重要。一般5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶被分為兩類。類型Ⅱ的AroA與類型Ⅰ序列一致性在30％左右。并且，類型Ⅱ

3、AroA在草甘膦存在時(shí)，相對(duì)于類型Ⅰ AroA表現(xiàn)出較高的催化效率。不過(guò)，2015年一種來(lái)源于惡臭假單胞菌4G-1的aroA基因表達(dá)的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶被分為第三類AroA。
　　自從1970s AroA受到關(guān)注，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和對(duì)AroA的深入研究，很多抗草甘膦aroA基因不符合轉(zhuǎn)基因的要求，比如，對(duì)PEP的親和性低。我們實(shí)驗(yàn)室先前研究中，具有高抗草甘膦(400 mM)和高親和PEP的來(lái)源于費(fèi)氏中

4、華根瘤菌NGR234（Sinorhizobium fredii NGR234）的AroA。根據(jù)Willcox的研究，基因aroA S.australis的來(lái)源菌-澳大利亞鏈球菌可以在濃度高達(dá)500mM生長(zhǎng)。我們的表達(dá)產(chǎn)物AroAS.australis有很多不同于別的AroA的特性。比如該酶的最適pH7.5-8.0明顯高于來(lái)源于大腸桿菌(pH5.5-6.0)、克雷伯氏菌肺炎(pH5.4和6.8)和核盤菌(pH7.2)，然而與本實(shí)驗(yàn)室先前研

5、究來(lái)源于中華根瘤菌EPSP酶接近(pH8.0)。除此之外，當(dāng)酶AroA S.australis在梯度pH緩沖液中處理，其在較廣的緩沖范圍中表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。因此證明，該酶可以在極端環(huán)境下保持穩(wěn)定，尤其是應(yīng)用在堿性土壤中。該酶的最適溫度是室溫30℃。研究中不同于其他AroA，很多一價(jià)金屬離子對(duì)該酶的基本沒(méi)有影響，而是有二價(jià)鎂離子、二價(jià)錳離子和二價(jià)鋅離子對(duì)該酶有一定的抑制影響，但也不是很明顯。抗草甘膦實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，草甘膦的濃度達(dá)150 m