抗草甘膦基因aroA-M1在優(yōu)良棉花品種上的應(yīng)用與研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文抗草甘膦基因aroA-M1在優(yōu)良棉花品種上的應(yīng)用與研究姓名：趙福永申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：徐培林20060601草劑轉(zhuǎn)基因棉花品種奠定基礎(chǔ)。草甘膦作為除草劑R o u n d u p @ 的活性成份，具有廣譜、高效、低毒、雜草難以產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，是一種理想的除草劑。其殺草機(jī)理主要是通過抑制芳香族氨基酸合成途徑中的5 ．烯醇式丙酮酰莽草酸．3 一磷酸合成酶( 5 - e n o l p y r u v

2、y l s h i k i m a t e 一3 ．p h o s a t es y n t h a s e ，E P S P S ) 的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，最終殺死雜草和作物。a r o A - M 1 基因是利用基因優(yōu)化( D N As h u f f l i n g ) 方法通過重組大腸桿菌( E s c h e r i c h i a c o l i ) 和鼠傷寒沙門氏桿菌( S a l m o n e l l

3、 at y p h i m u r i u m ) E P S P 合成酶基因獲得的突變體。檢測結(jié)果表明，其表達(dá)產(chǎn)物E P S P 合成酶對(duì)草甘膦的親和力明顯降低，對(duì)P E P 的結(jié)合能力明顯升高，從而大幅度提高了轉(zhuǎn)基因作物對(duì)草甘膦的抗性，這已在煙草和油菜的轉(zhuǎn)化中得到證明。研基因是根據(jù)天然C r y I A c 和C r y I A b 的氨基酸序列和使用植物偏好密碼子人工合成的，由中科院微生物所提供。本研究以p C A M B I A

4、 l 3 0 0 為基本載體，構(gòu)建了p G R A l 3 0 0 ( 抗蟲) 和p A M l B t ( 抗草甘膦抗蟲) 兩個(gè)植物表達(dá)載體。為了提高a r o A ．M 1 基因的表達(dá)效率，因此選用了增強(qiáng)的組成型3 5 S 啟動(dòng)子( C a M V 3 5 S ) ，并在其上游還連接了來自擬南芥E P S P S 基因葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽A S P( A r a b i d o p s i ss i g n a lp e p t i d e

5、 ) 的核苷酸編碼序列。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以a r o A - M 1 基因作為選擇標(biāo)記和草甘膦作為篩選劑，分別以棉花下胚軸和莖尖為外植體對(duì)優(yōu)良陸地棉栽培品種中棉3 5 、中棉2 7 、石遠(yuǎn)3 2 1 阻及棉花轉(zhuǎn)化模式品種珂字棉3 1 2 中進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。為了改善棉花的轉(zhuǎn)化效率，本研究還對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率的多個(gè)因子進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了以a r o A ．M 1 基因?yàn)檫x擇標(biāo)記、以莖尖為外植體的新型棉花轉(zhuǎn)化體系。本研究接種

6、中棉3 5 號(hào)、中棉2 7 號(hào)、石遠(yuǎn)3 2 1 和珂字3 1 2 下胚軸外植體數(shù)分別為3 0 0 0 、1 4 6 8 、1 6 6 2 和9 1 5 塊，得到的再生棉株數(shù)分別為5 9 、4 3 、5 8 和4 1株。對(duì)獲得的再生植株進(jìn)行P C R 分子檢測發(fā)現(xiàn)，9 3 ．3 ％以上均能擴(kuò)增得到1 ．3 一k b的a r o A - M 1 特異片段，7 8 ．9 ％以上能擴(kuò)增得到O ．9 6 ．k b 的研特異片段。就轉(zhuǎn)化率而言，中棉

7、3 5 號(hào)轉(zhuǎn)化率最低，為1 ．9 0 ±0 ．1 5 ％；其次為中棉2 7 號(hào)，2 ．8 6 ±0 ．3 7％，石遠(yuǎn)3 2 1 轉(zhuǎn)化率為3 ．4 3 ±O ．3 2 ％，轉(zhuǎn)化率最高為珂字3 1 2 ，4 ．2 6 ±0 ．4 5 ％。檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在T - D N A 整合到棉花基因組過程中大約有1 5 ％的歷基因丟失。接種中棉3 5 號(hào)、中棉2 7 號(hào)、石遠(yuǎn)3 2 1 和珂字3 1 2 莖尖外