GhEF1A8啟動(dòng)子克隆與功能分析及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花研究.pdf

1、棉花（Gossypium spp.）屬被子植物門、雙子葉植物綱、錦葵目、錦葵科木槿亞科、棉屬，是一種多用途的重要經(jīng)濟(jì)作物。早在9世紀(jì)便在中國(guó)發(fā)現(xiàn)棉花的種植，發(fā)展至今我國(guó)已成為世界最大產(chǎn)棉國(guó)之一，種植范圍遍及國(guó)內(nèi)25個(gè)省市自治區(qū)，創(chuàng)造了大量的經(jīng)濟(jì)收益和社會(huì)價(jià)值。近年來轉(zhuǎn)基因棉花特別是轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花與抗蟲棉在世界范圍內(nèi)的大規(guī)模推廣和應(yīng)用，變革了傳統(tǒng)的棉花耕種模式，大幅提高了棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，

2、但轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花的研制卻起步較晚，并未育成高效穩(wěn)定的抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花品種，為此本研究從植物基因工程角度出發(fā)，通過克隆分離棉花地上組織高效表達(dá)啟動(dòng)子、優(yōu)化改造草甘膦抗性基因、外源多基因組裝策略等方面的研究，對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花的研究進(jìn)行了新的探索。
　　首先以棉花組成型高表達(dá)蛋白質(zhì)延伸因子（GhEF1A）基因家族為切入點(diǎn)，對(duì)其9個(gè)家族成員的組織表達(dá)特性進(jìn)行分析，進(jìn)而采用基因組染色體步移（TAIL-PCR）技術(shù)分離獲得GhEF1

3、A8基因上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，在運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及其調(diào)控區(qū)域中潛在的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)之上，構(gòu)建了啟動(dòng)子全長(zhǎng)、5’UTR缺失及一系列啟動(dòng)子5’端缺失片段的植物表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因煙草 GUS的組織化學(xué)染色及熒光酶活測(cè)定，對(duì)啟動(dòng)子的組織表達(dá)特性及其活性調(diào)控的分子機(jī)理進(jìn)行了分析。同時(shí)對(duì)抗草甘膦新型EPSP合酶gr79基因及N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因進(jìn)行了密碼子改造和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化，結(jié)合GhEF1A8啟動(dòng)子與棉花葉綠體前導(dǎo)

4、肽（GhCTP）等載體元件構(gòu)建了一系列單雙價(jià)植物表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)分析及草甘膦抗性鑒定,初步驗(yàn)證了抗草甘膦基因的抗性，并獲得了對(duì)草甘膦有較強(qiáng)抗性的雙價(jià)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花?；谏鲜鲅芯浚玫街饕Y(jié)果如下：
　　1.對(duì)棉花GhEF1A基因家族表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn)其9個(gè)基因家族成員（GhEF1A1-GhEF1A9）高度同源，但在棉花葉片中表達(dá)強(qiáng)度有顯著差異，其中GhEF1A8基因表達(dá)量達(dá)到內(nèi)參基因Ghubi表達(dá)

5、量的8倍，遠(yuǎn)高于其他家族成員。此外GhEF1A8基因在棉花各組織部位都能表達(dá)，其中莖組織部位表達(dá)強(qiáng)度僅此于葉片基因表達(dá)量，表達(dá)量為內(nèi)參基因Ghubi的5倍以上。
　　2.首次分離獲得GhEF1A8基因上游啟動(dòng)子區(qū)，TAIL-PCR分離得到的序列片段長(zhǎng)1679-bp，其中包含了143-bp GhEF1A8基因編碼序列。采用PlantCARE、PLACE及ScanWM-P等生物信息學(xué)工具對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及潛在的順式調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)

6、現(xiàn)GhEF1A8啟動(dòng)子不僅存在TATA-box、CAAT-box、GC富集區(qū)等高等植物啟動(dòng)子基本調(diào)控元件，同時(shí)還包含了多種的逆境應(yīng)答元件及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如GT-1 motif、W-box、LTR和A/T-rich等。除此之外克隆得到的序列片段中包含了一個(gè)長(zhǎng)度為242-bp的5’UTR區(qū)域，該區(qū)域中存在一個(gè)非翻譯的外顯子、一個(gè)植物內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及一個(gè)5’UTR Py-rich stretch元件。
　　3.基于生物信息學(xué)分析結(jié)果，構(gòu)建了

7、GhEF1A8啟動(dòng)子全長(zhǎng)、5’UTR缺失及一系列啟動(dòng)子5’端缺失片段的植物表達(dá)載體并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化煙草研究。GUS組織化學(xué)染色及熒光酶活測(cè)定分析顯示， GhEF1A8啟動(dòng)子主要在煙草植株的地上組織表達(dá)，在葉片及莖組織中表達(dá)強(qiáng)度分別為CaMV啟動(dòng)子的2倍和4倍。5’UTR能夠在幾乎所有組織器官中增強(qiáng)GhEF1A8啟動(dòng)子的表達(dá)，尤其是在煙草葉片和莖組織中GUS活性分別提高了400％和600%。此外5’端序列缺失分析結(jié)果表明，-1081/-869

8、和-869/-373序列區(qū)域是啟動(dòng)子基本活性的正調(diào)控區(qū)，A/T-rich元件對(duì)啟動(dòng)子活性有增強(qiáng)作用。
　　4.對(duì)抗草甘膦新型EPSP合酶gr79基因及草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶gat基因進(jìn)行了密碼子改造和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化，結(jié)合GhEF1A8啟動(dòng)子與棉花葉綠體前導(dǎo)肽（GhCTP）等載體元件構(gòu)建了一系列單雙價(jià)植物表達(dá)載體并進(jìn)行了轉(zhuǎn)化煙草和棉花的研究。通過分子生物學(xué)分析及草甘膦抗性鑒定，證明轉(zhuǎn)化了gr79與gat基因的煙草與棉花獲得了一定的草甘膦

9、抗性，并初步比較了各基因及各載體轉(zhuǎn)化煙草植株的草甘膦抗性差異。
　　5.對(duì)獲得的雙價(jià)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花T0代及T1代植株進(jìn)行了進(jìn)一步分析，Southern blot、Western blot及大田草甘膦抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明gr79與gat基因已經(jīng)穩(wěn)定整合在棉花基因組中，但不同轉(zhuǎn)基因株系基因拷貝有差異，gr79基因能夠在棉花中被正確翻譯為目標(biāo)蛋白。獲得的雙價(jià)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花具有較強(qiáng)抗性,其抗性能初步達(dá)到田間草甘膦噴施要求，并且轉(zhuǎn)基因棉