微絲相關(guān)新基因hHBrk1的克隆及功能鑒定.pdf

1、細(xì)胞形態(tài)的變化可影響細(xì)胞內(nèi)大分子的代謝。細(xì)胞骨架對(duì)于細(xì)胞形態(tài)的維持起著主導(dǎo)作用，細(xì)胞表面的接觸和細(xì)胞形態(tài)的改變，都是通過(guò)細(xì)胞骨架成分，把信息傳導(dǎo)至核內(nèi)而引起細(xì)胞一系列生物化學(xué)反應(yīng)。微絲為直徑6nm的細(xì)絲，是細(xì)胞骨架的成分之一。微絲在細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)蛋白與執(zhí)行蛋白之間，搭建起一機(jī)械支架結(jié)構(gòu)，參與維持細(xì)胞的形態(tài)、肌肉收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬顒?dòng)，另外完整的微絲骨架是細(xì)胞內(nèi)源性信使協(xié)調(diào)作用的基礎(chǔ)。 在惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，細(xì)胞常

2、表現(xiàn)為細(xì)胞骨架的破壞和微絲的異常聚合。腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移與微絲及其相關(guān)蛋白的表達(dá)改變有關(guān)，微絲的異常聚合可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。因此深入研究腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找新的腫瘤運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因，可為腫瘤的生物治療提供治療靶點(diǎn)。本研究室以永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D和惡轉(zhuǎn)的BEPR35為研究對(duì)象，采用抑制性削減雜交和基因芯片技術(shù)，篩選到一在腫瘤中高表達(dá)的新基因序列表達(dá)標(biāo)簽(EST)。本實(shí)驗(yàn)采用生物信息學(xué)、RACE、Northern印跡雜

3、交、GSTpull-down、免疫共沉淀等技術(shù)，克隆了該基因，將之命名為hHBrk1，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步鑒定。實(shí)驗(yàn)分三部分內(nèi)容：1.hHBrk1基因的克隆和生物信息學(xué)分析；2.hHBRK1蛋白的細(xì)胞定位研究；3.hHBRK1相互作用蛋白的鑒定。 第一部分hHBrk1基因的克隆和生物信息學(xué)分析應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，從人的胎腦文庫(kù)中克隆了hHBrk1基因，并將它提交到Genbank中，序列號(hào)為AY148219和

4、AY148220。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hHBrk1基因位于3號(hào)染色體短臂的25.3-24.1區(qū)，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼75個(gè)氨基酸，分子量約9KD。Northern印跡雜交結(jié)果表明，hHBrk1基因在人體12種正常組織中均有表達(dá)，尤以心肌和骨骼肌為著。在人的胎腦、胎肝、胎肺和胎腎組織中表達(dá)豐度相似。同時(shí)Northern印跡雜交顯示hHBrk1基因有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別為1.1Kb和1.4Kb，與RACE的結(jié)果相符。 hHB

5、RK1蛋白家族保守性很強(qiáng)，與小鼠的同源蛋白只有1個(gè)氨基酸的差異，同源性達(dá)98％，與植物界相關(guān)蛋白的同源性達(dá)35％，提示hHBRK1蛋白為一在動(dòng)植物界高度保守的小分子蛋白質(zhì)。應(yīng)用PAIRCOIL軟件發(fā)現(xiàn)，hHBRK1蛋白家族存在一七重復(fù)(heptadrepeat，HR)結(jié)構(gòu)域。HR結(jié)構(gòu)域的特征為氨基酸每七個(gè)一組，分別命名為“abcde龜”，其中“a”和“d”位上的氨基酸均為疏水性的亮氨酸、異亮氨酸或其他疏水性的氨基酸。HR結(jié)構(gòu)域可形成特殊

6、的α螺旋，即卷曲螺旋(coiled-coil)，這個(gè)特征為微絲相關(guān)蛋白如肌球蛋白、肌鈣蛋白等共有的結(jié)構(gòu)域，可與其他有此結(jié)構(gòu)的蛋白形成異二聚體，或本身形成同源二聚體。 第二部分hHBRK1蛋白的細(xì)胞定位研究采用綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染具有高轉(zhuǎn)移潛能的大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株95D，熒光顯微鏡下觀察到hHBRK1蛋白在細(xì)胞間期定位于細(xì)胞漿，并且在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前沿富集；而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期后，hHBRK1蛋白出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，類似微絲蛋

7、白F-actin的分布，重新定位于細(xì)胞膜皮質(zhì)區(qū)和縊縮環(huán)。利用TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽顯示微絲，激光共聚焦技術(shù)顯示，hHBRK1蛋白與微絲蛋白在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的最前沿有共定位，提示hHBRK1蛋白為一微絲相關(guān)蛋白，可能參與微絲的聚合。 為進(jìn)一步研究hHBRK1蛋白的特異定位，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一系列缺失和突變體。分別將hHBRK1蛋白的N端46位和C端的39位氨基酸缺失，構(gòu)建了pGFP-hHBRK1△N(1-46)和pGFP-hHBRK1△C

8、(47-75)載體。將hHBRK1蛋白的第54位的亮氨酸突變?yōu)闃O性的親水性的精氨酸(hHBRK1R54)，另一突變體位點(diǎn)在第56位的亮氨酸和第57位的丙氨酸，構(gòu)建了pGFP-hHBRK1S56G57載體。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)：GFP-hHBRK1△N(1-46)和GFP-hHBRK1△C(47-75)融合蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)彌散分布，失去了野生型hHBRK1蛋白的特異細(xì)胞定位，而且GFP-hHBRK1△C(47-75

9、)蛋白不但在細(xì)胞中呈彌散分布，并在一細(xì)胞器中富集。本實(shí)驗(yàn)用高爾基復(fù)合體探針Ceromide標(biāo)記95D細(xì)胞后，激光共聚焦發(fā)現(xiàn)GFP-hHBRK1△C(47-75)和高爾基復(fù)合體共定位，提示hHBRK1蛋白結(jié)構(gòu)的完整性是其發(fā)揮作用的前提，hHBRK1蛋白的C端可能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸有關(guān)。GFP-hHBRK1S56G57和hHBRK1R54蛋白在細(xì)胞漿中彌散分布，失去了在細(xì)胞前沿富集的特征，提示HR結(jié)構(gòu)域在微絲的聚合過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

10、 為探討hHBRk1與微絲聚合的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)克隆了促微絲聚合的ARP2/3復(fù)合物中的Arp3基因，并將之同框插入到pEGFP-C1中。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，熒光顯微鏡下可看到ARP3蛋白在細(xì)胞漿中呈點(diǎn)狀分布，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前沿富集不明顯，在胞漿中局部有高亮點(diǎn)，ARP3蛋白亮點(diǎn)與微絲蛋白共定位，提示在95D細(xì)胞中存在異常的聚合。hHBrk1基因同框插入pDsRed2-C1載體中，表達(dá)RFP-hHBEK1蛋白。將pGFP-ARP3載體與pRF

11、P-hHBRK1載體共轉(zhuǎn)染95D細(xì)胞，激光共聚焦結(jié)果顯示：兩蛋白無(wú)明顯共定位現(xiàn)象，提示雖然二者均參與微絲的聚合，但它們之間存在一定的空間位置。 第三部分hHBRK1相互作用蛋白的鑒定為了探討hHBRK1蛋白的作用機(jī)制，本研究采用GSTpull-down、WesternBlot和免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)并鑒定了hHBRK1蛋白與小鼠的心肌TroponinT亞基結(jié)合。首先本實(shí)驗(yàn)將hHBrk1基因的開放閱讀框同框插入到pGEX-5T載體中，

12、構(gòu)建pGEX-hHBRK1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌K802，IPTG誘導(dǎo)GST-hHBRK1融合蛋白表達(dá)，谷胱苷肽瓊脂糖純化，得到GST-hHBRK1融合蛋白。選擇小鼠的心肌為研究對(duì)象，應(yīng)用GSTpull-down的方法，得到了一hHBRK1相互作用蛋白，肽脂紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)該蛋白為小鼠的肌鈣蛋白TEa亞型。以肌鈣蛋白T為一抗，Western印跡證實(shí)了hHBRK1和肌鈣蛋白T的相互作用。將hHBrk1基因同框插入pCMV-myc載體中，使hHB

13、RK1蛋白與myc標(biāo)簽融合表達(dá)，免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)了hHBRK1和肌鈣蛋白T結(jié)合。 綜合以上工作，本研究發(fā)現(xiàn)hHBRK1是一微絲相關(guān)蛋白，在動(dòng)植物中高度保守，含有HR結(jié)構(gòu)域。定位于細(xì)胞胞漿，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前沿富集，提示hHBRK1蛋白可能通過(guò)調(diào)控F-actin的聚合而參與調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。hHBRK1蛋白結(jié)構(gòu)的完整性是其發(fā)揮生物學(xué)功能必要條件，hHBRK1蛋白的C端序列參與其在高爾基復(fù)合體中的動(dòng)態(tài)平衡。hHBRK1蛋白與微絲結(jié)合蛋白T