依普拉芬及1,25二羥維生素D3對雞胚脛骨成骨細(xì)胞增殖及鈣通道TRPV6表達(dá)的影響.pdf

1、新型上皮性鈣通道成員的TRPV5/TRPV6表現(xiàn)為對鈣離子具有高度選擇性，對鈣離子代謝及骨代謝有著非常重要的作用。近來研究表明，雌激素、1，25二羥維生素D3、PTH、飲食鈣和藥物都可調(diào)節(jié)TRPV5/TRPV6的表達(dá)。研究顯示，TRPV5主要存在于腎，TRPV6主要存在于小腸，兩者在骨組織主要存在于成骨細(xì)胞。目前，國外研究已證明在腎TRPV5、在小腸TRPV6通道通過鈣的重吸收作用調(diào)節(jié)正常細(xì)胞內(nèi)、外的鈣水平;已發(fā)現(xiàn)大鼠BMSCs來源的成

2、骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中TRPV5和TRPV6鈣離子通道的表達(dá)，與顱骨來源的成骨細(xì)胞內(nèi)TRPV5和TRPV6的表達(dá)情況一樣。但是，針對雞胚脛骨成骨細(xì)胞內(nèi)TRPV6的表達(dá)情況以及與骨質(zhì)疏松的關(guān)系的研究尚未見文獻(xiàn)報道。
　　 雞胚脛骨來源的成骨細(xì)胞為研究成骨細(xì)胞在骨形成中的作用提供了最佳的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。采用酶消化和組織塊移行生長相結(jié)合的方法獲取成骨細(xì)胞。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察、噻唑藍(lán)(MTT)比色法、堿性磷酸酶染色(ALP)、鈣化結(jié)節(jié)染

3、色、姬姆薩染色從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)上對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果顯示，雞胚脛骨成骨細(xì)胞具有典型成骨細(xì)胞的形態(tài)特征、ALP活性等功能，符合細(xì)胞的生長特性，并可在體外發(fā)生鈣化。
　　 本試驗(yàn)取雞胚脛骨來源的成骨細(xì)胞，進(jìn)行植物雌激素依普拉芬或1，25二羥維生素D3的干預(yù)，應(yīng)用MTT法、RT-PCR以及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測成骨細(xì)胞的增殖活性、成骨相關(guān)性細(xì)胞因子的表達(dá)和TRPV6的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果表明，依普拉芬和1，25二羥維生素D3

4、均可促進(jìn)雞胚脛骨成骨細(xì)胞的增殖，并且增殖作用明顯(P＜0.05)，但當(dāng)濃度分別增大到10-4 mol·L-1和10-8 mol·L-1時，成骨細(xì)胞的增殖開始受到抑制;依普拉芬和1，25二羥維生素D3均可顯著地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的分泌(P＜0.05)，并且ALP mRNA的表達(dá)水平與細(xì)胞中堿性磷酸酶的分泌呈正相關(guān)。RT-PCR檢測顯示，依普拉芬在10-8mol·L-1時極顯著地促進(jìn)TRPV6 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，在10-10

5、 mol·L-1和10-6 mol·L-1時出現(xiàn)顯著地促進(jìn)(P＜0.05);而1，25二羥維生素D3在10-10mol·L-1和10-9mol·L-1時極顯著地抑制TRPV6 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，并且在濃度降低時出現(xiàn)促進(jìn)趨勢。依普拉芬對PMCA1b mRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)抑制作用，在10-6 mol·L-1時出現(xiàn)極顯著地抑制(P＜0.01)，10-10 mol·L-1和10-8 mol·L-1時出現(xiàn)顯著地抑制(P＜0.05)

6、;1，25二羥維生素D3對PMCA1b mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有規(guī)律的變化趨勢，但在10-11mol·L-1時出現(xiàn)極顯著地促進(jìn)(P＜0.01)，10-12 mol·L-1和10-10 mol·L-1時出現(xiàn)極顯著地抑制(P＜0.01)。依普拉芬在10-8 mol·L-1時極顯著地影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(P＜0.01)，在10-10 mol·L-1和10-6mol·L-1時出現(xiàn)顯著地促進(jìn)作用(P＜0.05);1，25二羥維生素D3在10-10m