依普拉芬對體外雞胚小腸上皮細胞新型鈣離子通道表達的影響.pdf

1、試驗Ⅰ、雞胚小腸上皮細胞培養(yǎng)與鑒定
　　 目的：培養(yǎng)雞胚小腸上皮細胞。方法：從18日齡雞胚中取一段十二指腸段，用組織塊培養(yǎng)法和以50μg·mL-1嗜熱菌蛋白酶與0.2 mg·mL-1膠原酶Ⅰ型聯(lián)合消化獲取的腸隱窩，在37.5℃、5％CO2的條件下，用含5％胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小腸上皮細胞。用差速消化法和差速貼壁法，進一步純化、傳代。采用形態(tài)學觀察、Giemsa染色和免疫化學染色法進行小腸上皮細胞鑒定。結果：組織塊培養(yǎng)法和酶聯(lián)

2、合消化培養(yǎng)法都可以得到雞胚小腸上皮細胞，純化后純度理想。結論：雞胚小腸上皮細胞培養(yǎng)成功，培養(yǎng)的細胞純度理想，為下一步研究提供了實驗材料。
　　 試驗Ⅱ、依普拉芬對雞胚小腸上皮細胞生長的影響
　　 目的：在建立雞胚小腸上皮細胞體外培養(yǎng)方法的基礎上，研究依普拉芬對雞胚小腸上皮細胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長狀態(tài)良好的第二代小腸上皮細胞接種于96孔板，添加含1％FBS的DMEM對照組和含不同濃度的依普拉芬實驗組，7

3、2 h后分別用MTT法、PNPP法測定小腸上皮細胞增殖率和小腸上皮細胞內堿性磷酸酶（ALP）活性。結果：（1）與對照組相比，10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1和10-8 mol·L-1的依普拉芬均顯著促進小腸上皮細胞增殖（P<0.01）；10-5 mol·L-1依普拉芬顯著抑制小腸上皮細胞的增殖（P<0.01）；（2）與對照組相比，10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1和10-8 mol·L-1依普拉芬極顯著

4、促進小腸上皮細胞ALP活性（P<0.01），10-9mol·L-1顯著促進小腸上皮細胞ALP活性（P<0.05）；10-5 mol·L-1的依普拉芬顯著抑制小腸上皮細胞內ALP活性（P<0.01）。結論：依普拉芬能顯著促進小腸上皮細胞的增殖；使小腸上皮細胞內的ALP顯著增加；但依普拉芬濃度越大，其上皮細胞則呈現(xiàn)明顯的抑制作用。
　　 試驗Ⅲ、依普拉芬對雞胚小腸上皮細胞鈣離子通道基因表達的影響
　　 目的：在建立雞胚小腸上

5、皮細胞體外培養(yǎng)方法的基礎上，研究TRPV6在小腸上皮細胞上表達的定位以及依普拉芬對TRPV6、CaBP-D28k和PM0Alb mRNA表達的影響。方法：免疫細胞化學方法研究TRPV6表達定位；用含10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-8 mol·L-1、10-9 mol·L-1和10-10 mol·L-1不同濃度的依普拉芬以及含1％FBS的DMEM對照組處理第二代雞胚小腸上皮細胞72 h后，用RT-PCR方法檢測其

6、TRPV6、CaBP-D28k和PMCAlbmRNA表達量變化。結果：（1）TRPV6表達定位于雞胚小腸上皮細胞胞膜上；（2）與對照組相比，10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-8 mol·L-1依普拉芬顯著上調PMCAlb和CaBP-D28k mRNA的表達（P<0.01），10-9 mol·L-1依普拉芬作用下TRPV6的表達出現(xiàn)明顯上升（P<0.05），10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-