斯鈣素1在初生奶牛胃腸道的表達(dá)及其對氧化應(yīng)激和新型鈣離子通道的影響研究.pdf

1、斯鈣素1(Stanniocalcin1，STC-1)是一種最初在硬骨魚類發(fā)現(xiàn)的低鈣性激素，在魚類它是由緊鄰腎臟而且在整個腎臟中均有分布的特殊器官—斯坦尼氏小體所分泌，該激素主要通過調(diào)節(jié)腮、小腸和腎臟Ca2+和無機(jī)磷酸鹽(Inorganicphosphate，Pi)的轉(zhuǎn)運來發(fā)揮其抗高鈣效應(yīng)。哺乳動物體內(nèi)，STC-1在多種器官中均有表達(dá)，包括Ca2+吸收上皮如小腸、回腸、腎臟、胎盤以及其它血管化組織。哺乳動物STC-1是一多功能效應(yīng)蛋白，如

2、它能調(diào)節(jié)腎臟和腸道Ca2+/Pi吸收，小鼠中其超表達(dá)可致高血Pi、侏儒癥、代謝率增加等效應(yīng)，近來發(fā)現(xiàn)它和癌癥也有一定的聯(lián)系。STC-1的表達(dá)受1，25(OH)2D3等理化因素調(diào)節(jié)。然而，STC-1在哺乳動物中的多種生理作用還未完全清楚，還有待進(jìn)一步研究。
　　1.原核表達(dá)牛源STC-1重組蛋白
　　本試驗以奶牛腎臟組織提取的總RNA合成cDNA，然后使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出除信號肽序列外的奶牛STC-1全長結(jié)構(gòu)基因。利用T-A克

3、隆原理將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將菌液進(jìn)行測序。結(jié)果表明該擴(kuò)增產(chǎn)物和GenBank登錄號BC105435.1奶牛斯STC-1基因序列完全符合。然后將測序正確的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并亞克隆到pET-32a+表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中，經(jīng)0.6mMIPTG誘導(dǎo)3h后，成功表達(dá)出奶牛STC-1融合蛋白。
　　2.STC-1蛋白在奶牛胃腸道

4、差異性表達(dá)情況
　　本實驗分別采用半定量實時熒光PCR和westernblotting技術(shù)來分析STC-1基因和蛋白相對表達(dá)量。STC-1基因表達(dá)情況以表達(dá)率形式予以展示:胃和腸道的相對表達(dá)值除以腎臟的相對表達(dá)值的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，在胃中STC-1基因和蛋白表達(dá)量最高是在皺胃;而在腸道中十二指腸和結(jié)腸的基因表達(dá)量最高，蛋白表達(dá)量最高卻是在十二指腸和空腸。腎臟中STC-1基因和蛋白的表達(dá)量均高于胃腸道中的表達(dá)量。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)腸道

5、斯鈣素1在30bp處出現(xiàn)免疫條帶，說明該STC-1可能分子量約為50kD(STC50)，而非更大分子量(bigSTC)。從結(jié)果可以看出STC-1表達(dá)最豐富的部位正好是胃腸道消化和吸收最活躍的部位，表明STC-1可能參與了奶牛消化與吸收過程。
　　3.新生牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立
　　本實驗建立了一種從新生犢牛小腸組織獲取小腸上皮細(xì)胞的方法。0.25％胰蛋白酶、0.1％膠原酶Ⅰ以及膠原酶Ⅺ/中性蛋白Ⅰ混合物等方法用于從小腸

6、組織分離小腸絨毛和隱窩。然后利用小腸上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的貼壁能力和對胰蛋白酶消化耐受性之間的差異來純化小腸上皮細(xì)胞。使用上皮細(xì)胞特異性角蛋白抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法來區(qū)別培養(yǎng)物中上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。光學(xué)和電子顯微鏡用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明所有分離方法均能分離一定量隱窩和/或腸絨毛，但膠原酶Ⅰ分離效率更高、所得消化物結(jié)構(gòu)更完整，但需要消化很長時間。原代培養(yǎng)物能在孵育3-7d內(nèi)貼壁，其間夾雜著一定量成纖維細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞。經(jīng)

7、多種方法純化后，能得到較高純度的上皮樣細(xì)胞，該培養(yǎng)物能存活1.5月并傳代5-7次。從培養(yǎng)細(xì)胞中能克隆到蔗糖酶、鈣結(jié)合蛋白和上皮鈣離子通道，說明該培養(yǎng)物保留了部分小腸上皮細(xì)胞生物活性。根據(jù)以上特點說明該培養(yǎng)物能用于小腸上皮細(xì)胞功能的研究。
　　4.STC-1對過氧化氫誘導(dǎo)的奶牛腸道上皮細(xì)胞損傷的作用研究
　　該研究利用H2O2處理原代小腸上皮細(xì)胞以模擬慢性腸炎造成的細(xì)胞損傷。上皮細(xì)胞經(jīng)重組質(zhì)粒超表達(dá)STC-1后，再由200μM

8、H2O2處理不同時間，以研究STC-1對氧化損傷的作用。AO/EB雙染色和臺盼藍(lán)排除法用于鑒定細(xì)胞的損傷情況，STC-1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況由Real-timePCR和westernblotting方法檢測。結(jié)果表明STC-1基因和蛋白表達(dá)均隨H2O2誘導(dǎo)時間延長而增加，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷也具有時間依賴而加劇的趨勢，該趨勢能為STC-1過表達(dá)而逆轉(zhuǎn)。此外，細(xì)胞過表達(dá)STC-1也能上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時輕微下調(diào)cas

9、pase-3的表達(dá)。本實驗表明STC-1保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的可能機(jī)制之一是它具有抗氧化和抗凋亡作用，因此，STC-1是奶牛慢性腸炎的一個潛在診斷或治療指標(biāo)。
　　5.STC-1對Caco2細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)作用研究
　　本實驗的目的是初步探索STC-1影響Ca2+吸收的可能分子機(jī)制，多種新型Ca2+通道和維生素D受體是本研究的對象。該實驗采用外源導(dǎo)入真核表達(dá)載體的方式增強(qiáng)Caco2細(xì)胞STC-1的表達(dá)，導(dǎo)入特異性siR

10、NA的方式抑制該激素的表達(dá)，兩方面分別觀察TRPV5、TRPV6、PMCA1b、NCX1和VDR等鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，增強(qiáng)STC-1表達(dá)后TRPV5、TRPV6和VDRmRNA和蛋白的表達(dá)水平均有所下調(diào)，而抑制了該激素的表達(dá)后TRPV5和TRPV6的表達(dá)有所上升，尤以TRPV6表達(dá)明顯，當(dāng)添加外源重組STC-1后，其表達(dá)又下調(diào)了。但增強(qiáng)和抑制該激素的表達(dá)都對PMCA1b和NCX1表達(dá)沒有顯著影響。因此，斯鈣素1影響上皮細(xì)胞