DMT1和鈣離子通道在星型膠質(zhì)細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞鉛吸收中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　鉛是最常見的環(huán)境重金屬污染物之一,在大氣、水、土壤中廣泛存在。鉛可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進(jìn)入人體,吸收入血后,經(jīng)過血液循環(huán)分布到各組織,可造成全身幾乎所有系統(tǒng)和器官的損害,而其中又以中樞神經(jīng)毒性作用最為受到關(guān)注。鉛的神經(jīng)毒性機(jī)制目前尚不完全清楚,而其在大腦中的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布規(guī)律、不同組織對(duì)鉛的親和性共同影響著鉛的毒性效應(yīng),因此,鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布規(guī)律及機(jī)制是深入揭示鉛神經(jīng)毒性機(jī)制的研究基礎(chǔ)和重要線索。
　　關(guān)

2、于鉛在大腦中轉(zhuǎn)運(yùn)分布規(guī)律和機(jī)制目前所知甚少。以往研究發(fā)現(xiàn):二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1(divalentmetaltransporter1,DMT1)、鈣離子通道、細(xì)胞內(nèi)吞作用、陰離子交換等均可能參與了細(xì)胞的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)過程。但是,不同的暴露方式下,不同器官和不同類型細(xì)胞中,鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)方式存在很大不同,導(dǎo)致鉛在不同組織、細(xì)胞吸收和分布的巨大差異。因此,研究鉛在不同類型神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的差異及其特點(diǎn),闡明相關(guān)的重要分子機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上探討可能的防治措施,是

3、預(yù)防醫(yī)學(xué)亟待解決的重要課題。
　　研究目的:
　　本研究以SD大鼠、大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6細(xì)胞、大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系Z310細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探討DMT1和鈣離子通道在星型膠質(zhì)細(xì)胞和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞鉛吸收過程中的不同作用,為闡明鉛在大腦不同類型神經(jīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、分布規(guī)律提供研究基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.建立亞慢性鉛暴露大鼠模型:21d初斷乳雄性SD大鼠,體重65±15g。鉛暴露組飲水法給予100pp

4、m醋酸鉛,對(duì)照組飲水給予100ppm醋酸鈉,無限制飲用8周。
　　2.建立鉛染毒細(xì)胞模型:大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6細(xì)胞、大鼠永生化脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞系Z310細(xì)胞、原代星型膠質(zhì)細(xì)胞分別體外培養(yǎng),鉛處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5μM醋酸鉛溶液。
　　3.采用原子吸收分光光度法檢測(cè)大鼠血液,大腦海馬、脈絡(luò)叢及C6細(xì)胞、Z310細(xì)胞中鉛含量,采用免疫熒光組化方法檢測(cè)海馬、脈絡(luò)叢及C6細(xì)胞、Z310細(xì)胞中DMT1的表達(dá)水平及鉛暴露對(duì)其表達(dá)水平的影

5、響。
　　4.采用Westernblot、Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)鉛暴露對(duì)C6細(xì)胞、Z310細(xì)胞DMT1蛋白與mRNA表達(dá)水平的影響。
　　5.采用鈣熒光探針Fluo-3/AM標(biāo)記技術(shù),激光掃描共聚焦顯微鏡觀察鉛對(duì)細(xì)胞鈣離子吸收的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.鉛暴露后,大鼠血液、腦脊液、大腦組織中的鉛水平一致性增高。
　　2.鉛對(duì)DMT1表達(dá)水平的影響:(1)免疫熒光染色結(jié)果顯示:SD大鼠海

6、馬和脈絡(luò)叢組織中DMT1均有較豐富的表達(dá),低劑量慢性鉛暴露并未顯著影響DMT1的表達(dá)水平,C6細(xì)胞和Z310細(xì)胞中DMT1表達(dá)水平不同,Z310細(xì)胞DMT1表達(dá)熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于C6細(xì)胞;(2)Western-blot、RT-PCR結(jié)果顯示:鉛對(duì)上述兩種細(xì)胞DMT1蛋白和mRNA表達(dá)水平均未產(chǎn)生顯著影響。
　　3.DMT1在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞鉛吸收中的作用:(1)原子吸收分光光度法結(jié)果顯示:DMT1siRNA干涉后,C6細(xì)

7、胞和Z310細(xì)胞鉛吸收均顯著降低,與C6細(xì)胞相比,Z310細(xì)胞鉛吸收的降低幅度更加顯著;(2)使用鐵螯合劑DFO使細(xì)胞處于缺鐵狀態(tài),兩種細(xì)胞鉛吸收量出現(xiàn)不同程度增加;而補(bǔ)鐵24h后,Z310細(xì)胞鉛吸收量顯著降低,C6細(xì)胞鉛吸收水平與對(duì)照組相比無顯著性差異。在細(xì)胞培養(yǎng)體系中同時(shí)加入等量鉛與鐵時(shí),兩種細(xì)胞鉛吸收水平均顯著降低。
　　4.激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:(1)對(duì)照組加入鈣離子激動(dòng)劑BayK8644后,C6細(xì)胞中鈣熒光強(qiáng)度增高,

8、之后逐漸減弱。與對(duì)照組相比,鉛預(yù)處理組C6細(xì)胞加入BayK8644后,細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光強(qiáng)度同樣增高,其峰值強(qiáng)度與對(duì)照組相近,但之后減弱的速度顯著加快;(2)而在鉛與BayK8644同時(shí)加入的情況下,細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的峰值比對(duì)照組顯著減弱,出現(xiàn)峰值的時(shí)間后移;(3)Z310細(xì)胞對(duì)照組加入BayK8644后,細(xì)胞中鈣熒光強(qiáng)度同樣出現(xiàn)增強(qiáng)現(xiàn)象,但顯著弱于C6細(xì)胞,之后逐漸減弱至對(duì)照組水平。與對(duì)照組相比,鉛預(yù)處理組Z310細(xì)胞加入BayK8644

9、后,細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光強(qiáng)度僅出現(xiàn)輕微增高;(4)而在鉛與BayK8644同時(shí)加入的情況下,Z310細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的峰值與對(duì)照組接近,但之后減弱的速度慢于對(duì)照組。
　　5.鈣離子通道在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞鉛吸收中的作用:(1)鈣離子通道激動(dòng)劑處理可引起C6細(xì)胞鉛吸收水平顯著增加,而Z310細(xì)胞無顯著變化;(2)鈣離子通道抑制劑處理后,C6細(xì)胞鉛吸收水平顯著降低,Z310細(xì)胞無顯著變化。(3)CaCl2預(yù)處理未引起兩種細(xì)胞鉛吸收

10、水平的顯著變化;CaCl2與鉛同時(shí)處理細(xì)胞時(shí),1mmol/LCaCl2處理組細(xì)胞鉛吸收量并未發(fā)生顯著改變,而10mmol/LCaCl2處理后,兩種細(xì)胞鉛吸收量均顯著增加。
　　研究結(jié)論：
　　1.DMT1和鈣離子通道在C6細(xì)胞和Z310細(xì)胞鉛轉(zhuǎn)運(yùn)過程中所起的作用不完全一致:C6細(xì)胞的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)以鈣離子通道為主,而Z310細(xì)胞的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)以DMT1為主。
　　2.補(bǔ)鐵能夠減少細(xì)胞的鉛吸收量,尤其是鐵和鉛同時(shí)存在的情況下,可以顯著