1α,25-二羥維生素D3對(duì)BMP2基因表達(dá)的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 維生素D3是目前臨床上治療骨質(zhì)疏松的常用藥物，它在體內(nèi)通過羥化生成活性代謝產(chǎn)物1，25(OH)2D3（1α，25-dihydroxyvitaminD3）而發(fā)揮生理作用。1，25(OH)2D3是一種具有多種生物效應(yīng)的激素前體，其主要是通過與靶細(xì)胞內(nèi)的維生素D受體(VitaminDreceptor，VDR)結(jié)合后調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其生理效應(yīng)。它具有促進(jìn)腸道鈣和磷的吸收，促進(jìn)腎小管對(duì)鈣、磷的重吸收的作用。它

2、一方面可以協(xié)同甲狀旁腺激素刺激骨組織脫鈣，提高血鈣、磷濃度;另一方面也可以抑制甲狀旁腺激素的合成釋放，從而抑制甲狀旁腺激素的骨溶解作用，使骨丟失減少。但是目前關(guān)于1，25(OH)2D3對(duì)骨形成及成骨細(xì)胞作用的報(bào)道仍很不一致。部分研究認(rèn)為1，25(OH)2D3可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化成熟，對(duì)骨組織的形成有直接的促進(jìn)作用。而另外一些研究則認(rèn)為1，25(OH)2D3對(duì)成骨細(xì)胞有明顯的抑制作用，直接抑制骨形成。因此，1，25(OH)2D3對(duì)骨形成的

3、作用及機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。
　　 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bonemorphogeneticprotein，BMP）是一組分泌性的多功能蛋白質(zhì)，除BMP1外均屬于TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子-β）超家族成員，在體內(nèi)可以通過旁分泌和自分泌的形式誘導(dǎo)骨的形成，是目前公認(rèn)最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)因子。BMP2是其中研究和應(yīng)用最廣泛的成骨生長因子之一，它可以在體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，體內(nèi)誘導(dǎo)骨形成。BMP2在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)骨形成中起著關(guān)鍵的作用，因

4、此任何影響B(tài)MP2基因表達(dá)的因素都可能會(huì)影響骨形成。
　　 若能闡明1，25(OH)2D3與BMP2基因表達(dá)的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步理解1，25(OH)2D3在骨形成中的作用會(huì)有很大的幫助，目前文獻(xiàn)中尚未有此類報(bào)道。
　　 遺傳性高鈣尿(Genetichypercalciuricstone-forming，GHS)大鼠是研究特發(fā)性高鈣尿(Idiopathichypercalciuria，IH)患者的理想動(dòng)物模型，它們都表現(xiàn)為小腸

5、的鈣吸收增加，腎臟的尿鈣重吸收減少，骨密度減低。既往的研究表明GHS大鼠中腸鈣吸收的增加，尿鈣重吸收的減少與組織中VDR水平的增加有很大的關(guān)系。但是GHS大鼠中骨密度減低的原因仍不是十分清楚。本研究旨在通過探尋GHS大鼠中VDR與BMP2的關(guān)系來分析這種動(dòng)物模型中骨密度減低的可能原因，并進(jìn)一步探討1，25(OH)2D3對(duì)BMP2基因表達(dá)的調(diào)控及可能的機(jī)制，從而進(jìn)一步分析1，25(OH)2D3在骨形成中的作用及機(jī)制。
　　 目的:

6、
　　 1、研究GHS大鼠和正常SD大鼠相同組織中維生素D受體蛋白和BMP2mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平并進(jìn)行比較，分析VDR和BMP2可能存在的聯(lián)系。
　　 2、體外培養(yǎng)GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，以及UMR-106細(xì)胞，研究1，25(OH)2D3對(duì)BMP2mRNA表達(dá)的影響。
　　 3、研究1，25(OH)2D3調(diào)控BMP2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用機(jī)制。
　　 4、探討DNA甲基化和組蛋白修飾在1，25

7、(OH)2D3調(diào)控BMP2基因表達(dá)中的作用。
　　 方法:
　　 1、選取成年GHS大鼠和SD大鼠，斷頸處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，抽取骨髓，應(yīng)用紅細(xì)胞裂解法及直接貼壁法獲取并體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，無菌條件下取出腎臟及小腸，置入液氮中快速冷凍。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)法檢測GHS和SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、腎臟和小腸中的維生素D受體蛋白的水平。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitativereal

8、-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)法檢測GHS和SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、腎臟和小腸中的BMP2mRNA的表達(dá)。
　　 2、分別應(yīng)用1，25(OH)2D3處理體外培養(yǎng)的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和UMR-106細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中BMP2mRNA表達(dá)的變化。
　　 3、應(yīng)用軟件分析BMP2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)可能的VDR結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)分析結(jié)果的基因序列，利用引物

9、設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0輔助設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物。
　　 4、應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChromatinImmuno-Precipitation，ChIP)檢測VDR與BMP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA的結(jié)合，應(yīng)用方法3中獲得的擴(kuò)增引物對(duì)ChIP產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。
　　 5、克隆方法4中獲得的BMP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)VDR結(jié)合位點(diǎn)的基因片段，構(gòu)建含此基因片段的熒光素酶基因表達(dá)載體，通過熒光素酶

10、報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析此片段的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 6、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2’-deoxycytidine(DAC)單獨(dú)或聯(lián)合1，25(OH)2D3處理體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和UMR-106細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR檢測BMP2mRNA的表達(dá)變化。組蛋白去乙酰酶抑制劑trichostatinA(TSA)單獨(dú)或聯(lián)合1，25(OH)2D3處理細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR檢測BMP2mRNA的表達(dá)變化。
　　 7、1，2

11、5(OH)2D3處理UMR-106細(xì)胞后提取基因組DNA，應(yīng)用重亞硫酸鹽焦磷酸測序法(Bisulfitepyrosequencing)檢測BMP2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)的改變。
　　 8、1，25(OH)2D3處理UMR-106細(xì)胞后，應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測BMP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)H3K9甲基化、組蛋白H3乙?；潭鹊母淖?。
　　 結(jié)果:
　　 1、GHS大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、腎臟和小腸中的維生素D受體

12、蛋白的水平較正常SD大鼠明顯增加，BMP2mRNA的表達(dá)較正常SD大鼠明顯降低。
　　 2、以10-8mol/L的1，25(OH)2D3分別處理體外培養(yǎng)的SD大鼠和GHS大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞6h、12h和24h，與空白對(duì)照組比較，BMP2mRNA的表達(dá)均明顯降低。以10-8mol/L的1，25(OH)2D3分別處理培養(yǎng)的UMR-106細(xì)胞1h、6h、12h、24h和48h，與空白對(duì)照組比較，BMP2mRNA的表達(dá)均明顯降低。以不同

13、濃度的1，25(OH)2D3分別處理體外培養(yǎng)的GHS大鼠和SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和UMR-106細(xì)胞24h，與空白對(duì)照組比較，BMP2mRNA的表達(dá)均明顯降低。
　　 3、軟件分析了包括BMP2基因及其側(cè)翼序列在內(nèi)的共計(jì)28，545bp的一段基因序列，共獲得8個(gè)可能存在的VDR結(jié)合位點(diǎn)(RegionA-H)。
　　 4、以VDR抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，將ChIP產(chǎn)物PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行凝膠電泳分析顯示VDR能結(jié)合BMP2轉(zhuǎn)

14、錄調(diào)控區(qū)的RegionC片段。
　　 5、成功構(gòu)建了pGL3-RegionC-promoter熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)MR-106細(xì)胞，結(jié)果顯示構(gòu)建的pGL3-RegionC-promoter熒光素酶報(bào)告基因與空白對(duì)照的PGL3-promoter相比，表達(dá)活性顯著降低。1，25(OH)2D3的處理，使報(bào)告基因的熒光素酶表達(dá)活性進(jìn)一步顯著降低。
　　 6、不同濃度(0.5，1，2umol/L)的DAC處理來源于G

15、HS大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及UMR-106細(xì)胞后，均顯著上調(diào)BMP2mRNA的表達(dá)，僅有0.5umol/L的DAC上調(diào)來源于SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中BMP2mRNA的表達(dá)。但是當(dāng)與1，25(OH)2D3聯(lián)合使用時(shí)，與單獨(dú)1，25(OH)2D3處理組相比，較高濃度(1，2umol/L)的DAC均能顯著上調(diào)三種細(xì)胞中BMP2mRNA的表達(dá)。
　　 7、不同濃度（20，100，500nmol/L）的TSA處理來源于SD大鼠的骨髓基質(zhì)干

16、細(xì)胞后，顯著上調(diào)BMP2mRNA的表達(dá)，而僅有20nmol/L的TSA上調(diào)來源于GHS大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中BMP2mRNA的表達(dá)。當(dāng)與1，25(OH)2D3聯(lián)合使用處理來源于SD和GHS大鼠的骨髓基質(zhì)于細(xì)胞，以及UMR-106細(xì)胞時(shí)，與單獨(dú)1，25(OH)2D3處理組相比，較高濃度(100，500nmol/L)的TSA均能顯著上調(diào)BMP2mRNA的表達(dá)。
　　 8、1，25(OH)2D3處理后，重亞硫酸鹽測序顯示BMP2基因轉(zhuǎn)

17、錄調(diào)控區(qū)RegionC區(qū)域的一個(gè)CpG位點(diǎn)完全甲基化，而對(duì)照組同一CpG位點(diǎn)仍呈去甲基化狀態(tài)。
　　 9、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測顯示1，25(OH)2D3處理UMR-106細(xì)胞后，提高了BMP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)RegionC區(qū)域H3K9甲基化的程度，顯著降低了BMP2轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)RegionC區(qū)域組蛋白H3乙酰化的程度。
　　 結(jié)論:
　　 1、在GHS大鼠的相同組織中，與正常SD大鼠比較，VDR水平升高而BMP2mRN