Mcm3及骨轉(zhuǎn)換相關(guān)基因表達(dá)與氟中毒關(guān)系的研究.pdf

1、目的：氟與人體生命活動(dòng)及牙齒、骨骼組織代謝密切相關(guān)。一方面，氟是預(yù)防齲齒有益的微量元素之一，另一方面，人體長(zhǎng)期暴露在高氟環(huán)境下，從外界環(huán)境獲得氟超過生理需要，可導(dǎo)致全身慢性中毒，成為地方性氟中毒。課題組前期研究采用基因芯片的方法對(duì)氟骨癥患者外周血淋巴細(xì)胞基因差異表達(dá)進(jìn)行了篩選發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與氟骨癥組比較后從中選出ras，TM9SF1，COL9A3，Mcm3四個(gè)基因予以研究。隨后發(fā)現(xiàn)Mcm3基因在小鼠成骨細(xì)胞染氟后，表達(dá)上調(diào)可達(dá)2.5倍，顯示

2、出可能具有氟中毒早期生物標(biāo)志意義。
　　 首先在人群中用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證Mcm3在暴露和非暴露組間的差異，與此同時(shí)測(cè)定和分析兩組的肝腎功能和transmembrane 9 superfamily member 1（TM9SF1）的表達(dá)。然后對(duì)Mcm3基因（minichromosome maintenance deficient 3）在氟中毒體外模型中的表達(dá)特征予以證實(shí)，同時(shí)觀察在不同劑量氟作用下體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞中Mcm3基

3、因在增殖成骨細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及對(duì)細(xì)胞增殖，氧化應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，骨轉(zhuǎn)化（堿性磷酸酶、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、Runx2、 Osterix、collagen I）情況，以求較完整的反應(yīng)氟中毒情況下Mcm3表達(dá)的變化和細(xì)胞內(nèi)其它分子反應(yīng)的概況，并在此基礎(chǔ)上探討氟骨癥發(fā)病可能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與調(diào)控機(jī)制，更進(jìn)一步揭示氟中毒所致氟骨癥的分子發(fā)病機(jī)制，為氟骨癥的早期診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 （1）選取飲水型氟中

4、毒輕度暴露者、對(duì)照各11例，采用SYBRGreen1嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測(cè)氟中毒暴露者和對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞中Mcm3和TM9SF1 mRNA的表達(dá)。生物化學(xué)方法測(cè)定兩組血清的反映肝、腎功能狀態(tài)的指標(biāo)。
　　 （2）體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞Saos-2，空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2.5、5、10、20、40、80mg/L NaF組為試驗(yàn)組，在24 h后以MTT法和Alamar Blue法測(cè)定氟作用下細(xì)胞的增殖以及酶學(xué)方

5、法測(cè)定氧化損傷（SOD，MDA）情況。提取成骨細(xì)胞RNA，采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time RT-PCR）方法檢測(cè)Runx2和Osterix mRNA及下游基因COL1A2的表達(dá)。用化學(xué)比色法測(cè)定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR）測(cè)定成骨相關(guān)基因：骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、

6、骨橋蛋白（osteopontin，OP）和Mcm3（minichromosone maintenance 3，Mcm3）的表達(dá)。以雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)比值。
　　 （3）原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞，并設(shè)立空白組和衣霉素陽(yáng)性對(duì)照組。24h后western blot檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)BIP、XBP-1、CHOP、PDI、Mcm3表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）暴露組、對(duì)照組人群Mcm3和TM9SF1 mRNA 表達(dá)

7、均略高于對(duì)照人群，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所測(cè)的肝腎功能指標(biāo)在兩組中差異未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 （2）與對(duì)照組相比，氟化鈉濃度小于20mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞均呈現(xiàn)出增殖作用。其中以10 mg/L（此時(shí)F-濃度約為4.52ppm）組的促增殖作用最強(qiáng)。當(dāng)氟化鈉濃度大于20mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞以抑制作用為主。兩種方法的結(jié)果相似。在受試時(shí)間內(nèi)80 mg/L組成骨細(xì)胞SOD活性較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）?？傮w上看，SOD活

8、性在氟作用受試濃度下，變化的波動(dòng)性不大。而2.5-80mg／L組MDA含量明顯增加，從20mg/L組起差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；總體上看，從2.5mg／L NaF組起的成骨細(xì)胞MDA水平逐漸提高。
　　 （3）成骨細(xì)胞在體外染氟培養(yǎng)24h后，Osterix的表達(dá)，與對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)出低劑量促進(jìn)表達(dá)，高劑量抑制表達(dá)的雙向反應(yīng)形式：在2.5mg/L時(shí)表達(dá)量呈上升水平，而后隨NaF劑量增加，表達(dá)下降明顯。當(dāng)NaF劑量為2.5-5mg/L時(shí)成

9、骨細(xì)胞內(nèi)基因Runx2表達(dá)水平均有不同程度增加，隨后逐漸下降，至5mg/L時(shí)為最低。Ⅰ型膠原表達(dá)方式呈現(xiàn)出雙向反應(yīng)：劑量為2.5mg/L時(shí)，表達(dá)上調(diào)；劑量為5～80mg/L時(shí)，表達(dá)下調(diào)。
　　 （4）隨著氟化鈉濃度的增高，ALP的活性增加。在NaF劑量為2.5～5.0mg/L時(shí)Mcm3表達(dá)與對(duì)照組相比是下降的，在10mg/L時(shí)表達(dá)為對(duì)照組的21.3倍，但在20、40 mg/L時(shí)表達(dá)量又低于對(duì)照組；OC的表達(dá)從2.5 mg/L時(shí)開

10、始隨劑量上升而下調(diào)；BSP的表達(dá)試驗(yàn)組2.5～10 mg/L 時(shí)BSp較對(duì)照組表達(dá)明顯上調(diào)，當(dāng)作用劑量為20～40mg/L時(shí)BSP表達(dá)明顯下降，僅略高于對(duì)照組；OP表達(dá)量在7個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均高于對(duì)照組，基本上呈現(xiàn)出隨劑量升高表達(dá)量下降，至40mg /L時(shí)表達(dá)量最低。
　　 （5）各干預(yù)組PDI蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照與比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），XBP-1在10mg/L氟化鈉組起表達(dá)明顯高于空白對(duì)照，并隨氟劑量表達(dá)量增加。從

11、2.5mg/L氟化鈉組起骨細(xì)胞中的BIP/β-actin高于對(duì)照組（P＜0.05）；從10mg/L氟化鈉起，各加氟組的CHOP／GAPDH比對(duì)照組高（P＜0.05）。Mcm3蛋白表達(dá)能夠被衣霉素所下調(diào)，而在其它濃度的氟作用下均有不同程度的表達(dá)上調(diào)，但無(wú)明顯劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 （1）氟暴露可以使患者外周血中Mcm3和TM9SF1 mRNA表達(dá)輕度上調(diào)，兩種指標(biāo)在兩組調(diào)查人群中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氟對(duì)暴露者肝

12、、腎功能的影響需要選取更多的指標(biāo)綜合分析，需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。
　　 （2）NaF具有低劑量促進(jìn)細(xì)胞增殖，高劑量抑制細(xì)胞增殖的雙相作用。氟對(duì)成骨細(xì)胞可以造成氧化損傷。
　　 （3）Mcm3表達(dá)不規(guī)律并不適合作為診斷及監(jiān)測(cè)成骨細(xì)胞在過量氟作用下的生物標(biāo)志。氟化鈉可能通過影響各成骨相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)成骨分化。
　　 （4）氟可影響成骨細(xì)胞Runx2和Osterix mRNA表達(dá)，表達(dá)水平與染氟的劑量有關(guān)。Runx2和O