甲拌磷急性中毒相關(guān)基因在大鼠臟器的表達(dá)研究.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測大鼠臟器中（心、肝、肺、腦和腸）甲拌磷中毒相關(guān)基因（AChE、BChE、PON-1和FOS）mRNA的表達(dá)，篩選出表達(dá)變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臟器和中毒相關(guān)基因；檢測中毒相關(guān)基因在中毒致死大鼠臟器中的mRNA表達(dá)量，探討甲拌磷中毒相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化在中毒死亡時(shí)間推斷的可行性，在法醫(yī)學(xué)中為甲拌磷中毒死亡時(shí)間的推斷提供科學(xué)的依據(jù)。
　　方法：
　　健康成年雌性SD

2、大鼠24只，隨機(jī)分為空白對照組、急性中毒死亡組、中毒死亡1d組和中毒死亡7d組。急性中毒死亡組、中毒死亡1d組和中毒死亡7d組分別用3LD50的甲拌磷對大鼠進(jìn)行灌胃，死亡后分別立即解剖取心、肝、肺、腦和腸，放置1d后解剖取肝臟和放置7d后解剖取肝臟?？瞻讓φ战M用同樣體積的生理鹽水對大鼠進(jìn)行灌胃，乙醚麻醉后立即解剖取心、肝、肺、腦和腸，實(shí)驗(yàn)組和空白對照組所取樣本重量均約為30mg，取材后立即置于液氮中保存待檢。各樣本用 TRIzol總RN

3、A提取試劑TRIzol Reagent提取總RNA，1％非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測總 RNA純度、濃度及其完整性，以β-actin作為內(nèi)參基因，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，梯度濃度稀釋 cDNA原液，分別建立AChE、BChE、PON-1、FOS和β-actin的相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；SYBR Green I嵌合熒光法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測各目的基因 mRNA相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究其在中毒致死大鼠臟器表達(dá)量的

4、變化。
　　結(jié)果：
　　提取的總RNA經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測純度、濃度及其完整性較好，均可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　內(nèi)參基因β-actin與目的基因 AChE、BChE、PON-1和 FOS的擴(kuò)增效率分別為109.2％、100.9％、108.7％、105.3％和100.91％，一致性較好，說明內(nèi)參基因選擇正確；擴(kuò)增曲線為光滑的S型曲線，基線較平，拐點(diǎn)清楚，平臺期平行性較好，說明反應(yīng)過程良好，沒

5、有非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，引物設(shè)計(jì)良好且特異性強(qiáng)；β-actin基因熔解溫度為85℃，AChE、BChE、PON-1和FOS基因熔解溫度分別為87.5° C、82.5℃、81.5℃和89℃，熔解曲線是單一的較高的尖峰，底部平而窄，無雜峰出現(xiàn)，說明這些基因擴(kuò)增的特異性較強(qiáng)，沒有引物二聚體的出現(xiàn)。
　　急性中毒死亡組目的基因AChE、BChE、PON-1和FOSmRNA在大鼠心臟中表達(dá)分別為空白對照組的8.79倍（P>0.05）、1.86倍

6、(P<0.05)、45.64％(P>0.05)和1.15倍(P>0.05)；肝臟中分別為空白對照組的8.59倍（P<0.05）、1.89倍（P<0.05）、1.09倍（P>0.05）和3.60倍（P<0.05）；肺中分別為空白對照組的5.44％（P<0.05）、67.00％(P>0.05)、1.11倍(P>0.05)和3.99倍(P>0.05)；腦中分別為空白對照組的10.69％（P<0.05）、92.54％(P>0.05)、2.12倍

7、(P>0.05)和13.91％(P<0.05)；腸中分別為空白對照組的8.01％（P>0.05）、1.08倍(P>0.05)、0.84％(P>0.05)和49.86％(P>0.05)。
　　中毒死亡1d組目的基因AChE、BChE、PON-1和FOSmRNA在大鼠肝臟中表達(dá)分別為空白對照組的53.92倍（P<0.05）、33.64％(P<0.05)、46.25％(P<0.05)和1.33倍(P>0.05)；中毒死亡1d組各目的基因

8、mRNA在大鼠肝臟中表達(dá)分別為急性中毒死亡組的6.27倍（P>0.05）、17.80％(P<0.05)、42.43％(P<0.05)和37.02％(P<0.05)。
　　中毒死亡7d組肝臟中提取的總RNA經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)已無明顯的條帶（18S和28S），逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后也無明顯的S型擴(kuò)增曲線，說明7d后各基因的總RNA已降解，可認(rèn)為其表達(dá)量為0。
　　結(jié)論：
　　除了PON-1基因以外，肝臟

9、中AChE、BChE和FOS基因mRNA的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以作為甲拌磷急性中毒相關(guān)基因表達(dá)研究的靶器官；BChE基因在心臟和肝臟中表達(dá)穩(wěn)定且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以作為甲拌磷急性中毒的基因表達(dá)標(biāo)志；急性中毒死亡組、中毒死亡1d組在肝臟中BChE基因mRNA的表達(dá)分別為空白對照組的1.89倍（P<0.05），33.64％(P<0.05)，表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，與急性甲拌磷農(nóng)藥中毒死后放置時(shí)間存在一定的關(guān)系，其時(shí)序性變化可望作為急性甲拌