氟病區(qū)人群健康效應(yīng)與鈣代謝相關(guān)基因關(guān)系的研究.pdf

1、地方性氟中毒以牙齒、骨骼為主要受累器官。氟是一種已知的可影響骨形成的非激素因子，高氟對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和骨代謝的影響已經(jīng)得到人們的公認(rèn)。氟化物對(duì)骨骼作用強(qiáng)弱的差異破壞了骨形成和骨吸收間的平衡，使骨的新陳代謝呈現(xiàn)出病理狀態(tài)，從而使骨密度改變錯(cuò)綜復(fù)雜。 河南省是我國(guó)飲水型地氟病流行的嚴(yán)重省份之一。盡管地方性氟中毒的病因己十分明確，但在同樣的生活環(huán)境、同樣接觸水平的人群中，不同個(gè)體患病與否及其患病的程度截然不同，提示個(gè)體對(duì)氟敏感性或耐受性存在

2、差異。能否通過對(duì)氟暴露易感基因的篩選闡明高氟影響人群骨代謝的遺傳先天性與環(huán)境后天性的關(guān)系，值得探討。 氟對(duì)骨骼系統(tǒng)的作用，主要是通過對(duì)鈣調(diào)節(jié)激素的作用實(shí)現(xiàn)的。骨鈣素(Osteocalcin，OC)是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，同時(shí)也是骨礦化過程的決定因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，骨鈣素基因缺陷小鼠骨量增多、骨質(zhì)改善，說明該基因是骨形成的負(fù)調(diào)控因子。 骨組織間質(zhì)的重要成分之一是膠原。過量的氟進(jìn)入骨組織，使骨膠原成熟過程減慢，合成障礙。由

3、于膠原含量減少，纖維密度降低、變短，形成異常形態(tài)結(jié)構(gòu)的骨膠原。Ⅰ型膠原α<,2>鏈(Collagen typeⅠalpha2，COL1A2)基因?qū)C(jī)體骨質(zhì)結(jié)構(gòu)塑建和骨機(jī)械強(qiáng)度均有影響。有動(dòng)物試驗(yàn)表明，攜帶COL1A2(omi)非致命隱性遺傳突變的大鼠，可導(dǎo)致一系列從輕微到致死性的成骨不全表型。 鑒于骨鈣素和Ⅰ型膠原對(duì)骨代謝的影響，結(jié)合高氟暴露致氟斑牙、骨組織異常改變的病理生理機(jī)制及相關(guān)的文獻(xiàn)資料，本研究通過分析對(duì)氟中毒人群和健康

4、人群進(jìn)行基因型分析，探討OC基因和COL1A2基因多態(tài)性與飲水型氟病區(qū)人群氟中毒遺傳易感性的關(guān)系。 方法： 1.調(diào)查點(diǎn)的選擇：選擇平均水氟濃度為3.1mg/l的河南省開封縣某村為高氟區(qū)。選擇經(jīng)濟(jì)水平、自然條件、農(nóng)作物種類、生活習(xí)慣、人口構(gòu)成與調(diào)查點(diǎn)基本相同，水氟濃度小于1.0mg/L的地區(qū)作為對(duì)照區(qū)。兩區(qū)均無工業(yè)氟污染和接氟工種暴露。 2.調(diào)查對(duì)象的確定：分別選擇高氟區(qū)及對(duì)照區(qū)在當(dāng)?shù)鼐幼?年以上的中國(guó)漢族居民進(jìn)行

5、健康體檢，排除肝、腎功能異常、遺產(chǎn)病患者、骨代謝病或髖骨骨折、接受鈣劑、氟化物及激素替代治療者。240名8～12歲兒童和183名18～55歲成人入選。 3.人體負(fù)荷及健康效應(yīng)指標(biāo)調(diào)查：應(yīng)用放免法測(cè)定其血清中骨鈣素(OC)和降鈣素(CT)的水平。Dean氏法檢查兒童氟斑牙患病情況，骨骼X線檢查成人骨組織異常改變。 4.基因型分析：PCR擴(kuò)增目的片段，分別對(duì)COL1A2 PvuⅡ，Rsa Ⅰ和OC HindⅢ多態(tài)性進(jìn)行RFL

6、P基因分型分析。 5.對(duì)COL1A2.PvuⅡ不同基因型PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，用DNAMAN分析測(cè)序結(jié)果，尋找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)。 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。主要方法包括：列聯(lián)表資料的X<'2>檢驗(yàn)、多因素非條件Logistic回歸、數(shù)值變量的協(xié)方差分析、兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析、Pearson相關(guān)分析等。以α=0

7、.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果： 1.地方性氟中毒的環(huán)境流行病學(xué)調(diào)查顯示：共發(fā)現(xiàn)75名氟斑牙兒童，均來自高氟區(qū)。高氟地區(qū)8～12歲兒童氟斑牙患病率為52.08％，明顯高于對(duì)照區(qū)。高氟區(qū)成人骨組織異常陽性率高于對(duì)照區(qū)(88.00％vs.46.15％)。高氟區(qū)氟斑牙患者血清OC和CT均高于對(duì)照區(qū)非患者(P<0.05)，但與高氟區(qū)非患者無顯著性差異。 2.COL1A2、OC基因多態(tài)性與氟斑牙易感性氟斑牙患者與非患者COL1A

8、2PvuⅡ、RsaⅠ基因型頻率分布無顯著性差異。在調(diào)整年齡、尿氟濃度等因素后，與攜帶Pp和PP基因型攜帶PP基因型的兒童患氟斑牙的危險(xiǎn)性增加151％(校正OR=2.51)。僅分析高氟區(qū)144名兒童氟斑牙易感性與該多態(tài)性的關(guān)系時(shí)，攜帶突變純合型PP的兒童患氟斑牙的危險(xiǎn)性是pp基因型的4.7倍，且在隱性模型中，與PP型/Pp型比較，攜帶PP基因型的兒童也顯著增加患氟斑牙的危險(xiǎn)(OR=5.99,P<0.05)。OC HindⅢ基因多態(tài)性與兒童

9、氟斑牙無相關(guān)關(guān)系。尚未發(fā)現(xiàn)COL1A2.PvuⅡ、OC HindⅢ基因多態(tài)性與成人骨組織異常有關(guān)聯(lián)。 3.成人COL1A2、OC基因多態(tài)性分布高氟區(qū)與對(duì)照區(qū)成人COL1A2PvuⅡ、OC.HindⅢ基因型頻率分布無顯著性差異(P>0.05)。人群骨組織異常改變與上述基因型頻率分布無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。 4.COL1A2 C19994A突變鑒定測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)C19994A突變，但未檢測(cè)到文獻(xiàn)報(bào)道的G19713C突變；測(cè)序

10、結(jié)果與GenBank中COL1A2 cDNA進(jìn)行同源分析顯示，突變型和野生型COL1A2序列19996堿基處均存在T→C改變。 小結(jié)： 1.高氟暴露人群已出現(xiàn)氟中毒骨相損害，作為反映機(jī)體氟效應(yīng)的指標(biāo)，血清OC、CT和AKP較氟斑牙、骨組織異常更為敏感，這為進(jìn)一步探討敏感性生物標(biāo)志物提供了方向。 2.開封縣某高氟村氟斑牙兒童COL1A2 PP基因型的頻率明顯高于本地區(qū)正常對(duì)照人群，兩者比較有顯著性差異。結(jié)果提示，C

11、OL1A2 PP基因型可能是兒童氟斑牙易感基因型。 3.開封縣某高氟村氟斑牙兒童COL1A2 RsaⅠ基因、OC HindⅢ各基因型分布與本地區(qū)正常對(duì)照人群比較，兩者無顯著性差異。結(jié)果提示，COL1A2Rsa Ⅰ基因、OC HindⅢ基因多態(tài)性與兒童氟斑牙無相關(guān)性。 4.通過對(duì)COL1A2 Pvu Ⅱ基因PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果分析，在該基因19713堿基處(24內(nèi)含子)并未檢測(cè)到文獻(xiàn)報(bào)道的G→C突變，但發(fā)現(xiàn)了C19994