納米細(xì)菌對(duì)人正常肝細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的影響和機(jī)制探討.pdf

1、第一部分 目的：檢測(cè)病毒性肝炎后肝硬化組織中是否存在納米細(xì)菌，并對(duì)可能存在的納米細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定及培養(yǎng)。 方法：手術(shù)中獲取的12例病毒性肝炎后肝硬化組織及12例正常肝組織標(biāo)本，分別切取部分存于4％中性甲醛溶液中作石蠟包埋切片，以免疫組化法作納米細(xì)菌檢測(cè)。其余液氮速凍后存于-70℃冰箱，留作納米細(xì)菌的分離，納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法和電鏡檢測(cè)進(jìn)行鑒定。對(duì)分離的納米細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中檢測(cè)電解質(zhì)及葡萄糖濃度的變化

2、。 結(jié)果：12例病毒性肝炎后肝硬化組織中10例納米細(xì)菌檢測(cè)陽性，2例陰性，12例正常肝組織中1例納米細(xì)菌檢測(cè)陽性，11例陰性，肝硬化組織中納米細(xì)菌感染率高于正常肝組織(P<0.05)。納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法檢測(cè)時(shí)，納米細(xì)菌可發(fā)出綠色熒光。透射電鏡下測(cè)量納米細(xì)菌直徑大小約為100～300nm。納米細(xì)菌培養(yǎng)過程中，K+、Na+、Cl-、Mg2+及葡萄糖的濃度無明顯變化(P>0.05)，而Ca2+、P3-濃度進(jìn)行性下降，每周

3、檢測(cè)結(jié)果比較存在顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：病毒性肝炎后肝硬化組織中存在納米細(xì)菌。納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法快速準(zhǔn)確鑒定納米細(xì)菌，電鏡有助于納米細(xì)菌檢測(cè)。納米細(xì)菌培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中消耗Ca2+、P3-，而不利用K+、Na+、Cl-、Mg2+及葡萄糖。 第二部分納米細(xì)菌對(duì)人正常肝細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的影響 目的：觀察納米細(xì)菌對(duì)人正常肝細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的變化及是否有損傷作用。 方法：光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)

4、菌作用于人正常肝細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)后生物學(xué)形態(tài)的改變；MTT比色實(shí)驗(yàn)和LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度納米細(xì)菌作用后人正常肝細(xì)胞存活和增殖情況，并檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NO的變化。 結(jié)果：不同濃度納米細(xì)菌作用后，光鏡下觀察人正常肝細(xì)胞形態(tài)存在不同程度改變，極低濃度時(shí)(OD=0.001,0.009)無明顯變化，隨濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，正常肝細(xì)胞外觀上逐漸出現(xiàn)細(xì)胞容量增加，腫脹，輪廓不清，細(xì)胞膜損傷破裂，甚至完全解體而無細(xì)胞結(jié)構(gòu)。不同濃度納

5、米細(xì)菌作用48小時(shí)后：除OD=0.001組外，各濃度組MTT值低于對(duì)照組MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)，各濃度組之間比較存在顯著性差異(P<0.05)。作用72小時(shí)后：OD=0.137組和OD=0.246組的MTT值比較無顯著性差異(P>0.05)，其余各濃度組之間比較仍存在顯著性差異(P<0.05)。比較不同時(shí)間點(diǎn)(48小時(shí)和72小時(shí))：OD=0.001，0.009時(shí)72小時(shí)的MTT值高于48小時(shí)的MTT值(P<0.05)。

6、OD=0.018，0.031，0.048，0.137時(shí)72小時(shí)的MTT值低于48小時(shí)的MTT值(P<0.05)。OD=0.246時(shí)48小時(shí)的MTT值和72小時(shí)的MTT值比較無顯著性差異(P>0.05)。不同濃度納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞時(shí)的LDH值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=712.064，P<0.01)，不同時(shí)間點(diǎn)的LDH值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=432.120,P<0.01)。納米細(xì)菌濃度與作用時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(F=217.308,P<0

7、.01)。與正常肝細(xì)胞組相比較，除OD=0.001組納米細(xì)菌與其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.835)外，其余各組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著納米細(xì)菌濃度的逐步提高，各時(shí)間點(diǎn)LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放的量逐漸升高，并與0小時(shí)比較存在顯著性差異(P<0.05)。NO檢測(cè)：不同濃度納米細(xì)菌作用于人正常肝細(xì)胞時(shí)，除OD=0.001.組與正常肝細(xì)胞對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P=0.206)，其余各組與對(duì)照組及不同濃度NB組兩兩比較

8、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。納米細(xì)菌濃度與作用時(shí)間之間有交互作用(F=625.454，P<0.001)。 結(jié)論：納米細(xì)菌可以損傷人正常肝細(xì)胞，隨著濃度升高及作用時(shí)間延長(zhǎng)，損傷程度越重，且在作用過程中產(chǎn)生NO，存在著濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。 第三部分納米細(xì)菌損傷人正常肝細(xì)胞機(jī)制的初步探討 目的：探討納米細(xì)菌對(duì)人正常肝細(xì)胞的損傷機(jī)制。 方法：采用線粒體探

9、針觀察不同濃度納米細(xì)菌作用人正常肝細(xì)胞時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)線粒體通透性孔道的開放情況，并結(jié)合電鏡下線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，三磷酸腺苷檢測(cè)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 結(jié)果：(1)OD=0.001納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞6小時(shí)后，即可以觀察到線粒體瞬時(shí)通透性孔道有一定程度的開放，部分線粒體跨膜電位出現(xiàn)下降。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的線粒體瞬時(shí)通透性孔道進(jìn)一步開放，至36小時(shí)，鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度進(jìn)一步減弱，MitoTracker CMXRos熒光由于

10、線粒體的崩解，彌散分布于細(xì)胞內(nèi)。48小時(shí)，整個(gè)視野的鈣黃綠素?zé)晒鈴?qiáng)度明顯黯淡，MitoTrackerCMXRos熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布顯得紊亂，無法分辨線粒體外形。結(jié)合同時(shí)間點(diǎn)電鏡圖片可以發(fā)現(xiàn)此時(shí)的線粒體出現(xiàn)明顯的嵴丟失及空泡化。至72小時(shí)，幾乎無鈣黃綠素?zé)晒猓曇暗牡咨@示為熒光染料的殘跡，MitoTracker CMXRos熒光強(qiáng)度黯淡，分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散在聚集，線粒體跨膜電位完全消失。整個(gè)過程中，細(xì)胞核仍然維持完整。OD=0.246納米

11、細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞3小時(shí)即可觀察到PTP開放，6小時(shí)即可以看到鈣黃綠素?zé)晒饷黠@減弱，線粒體跨膜電位已經(jīng)開始出現(xiàn)下降。12小時(shí)，鈣黃綠素?zé)晒膺M(jìn)一步減弱，部分線粒體跨膜電位的降低及消失。14小時(shí)，線粒體已經(jīng)破裂，MitoTracker CMXRos熒光染料外溢至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。16小時(shí)，鈣黃綠素?zé)晒饣鞠?，大部分線粒體的跨膜電位消失。24小時(shí)，僅僅殘留著鈣黃綠素?zé)晒馊玖霞癕itoTracker CMXRos染料痕跡，已無完整的細(xì)胞核及細(xì)胞形態(tài)

12、。 (2)OD=0.001納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞36小時(shí)，電鏡下可以看到細(xì)胞內(nèi)大部分線粒體已經(jīng)廣泛空泡化，嵴丟失。在OD=0.246作用正常肝細(xì)胞12小時(shí)，電鏡下觀察到線粒體變得腫脹，嵴結(jié)構(gòu)紊亂，16小時(shí)則觀察到肝細(xì)胞線粒體均已經(jīng)空泡化，但是細(xì)胞核仍維持完整。 (3)OD=0.246組納米細(xì)菌攻擊正常肝細(xì)胞6小時(shí)引起凋亡。 OD=0.001組納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞凋亡。OD=0.018組納米細(xì)菌

13、作用24小時(shí)僅僅出現(xiàn)一個(gè)較低的凋亡峰。 (4)三磷酸腺苷檢測(cè)：不同濃度的納米細(xì)菌作用人正常肝細(xì)胞時(shí)RLU值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.808,P=0.013)。正常肝細(xì)胞組與OD=0.001，0.018組之間RLU值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.614，0.213)，而與OD=0.048,0.137及0.246組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034，0.004，0.004)。OD=0.137與0.246組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.970

14、)。不同時(shí)間點(diǎn)之間RLU差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(F=251.181,P<0.001)，除0.5小時(shí)與0小時(shí)(P=0.144)，0.5小時(shí)與1小時(shí)之間(P=0.053)，6小時(shí)與48小時(shí)(P=0.080)，12小時(shí)與24小時(shí)之間(P=0.366)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較RLU值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。納米細(xì)菌濃度與攻擊時(shí)間有交互作用(F=142.551，P<0.001)。 結(jié)論： 1.納米細(xì)菌對(duì)