防治西花薊馬的球孢白僵菌液固雙相發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、西花薊馬Frankliniella occidentalis( Pergande)是一種世界性分布的危險(xiǎn)害蟲(chóng)，2003年在我國(guó)北京發(fā)現(xiàn)后，迅速擴(kuò)散并局部暴發(fā)成災(zāi)，對(duì)我國(guó)的農(nóng)作物生產(chǎn)造成極大的危害，成為我國(guó)一種重要外來(lái)入侵害蟲(chóng)。西花薊馬不僅可以直接取食植物汁液導(dǎo)致植物萎蔫減產(chǎn)，還可以傳播多種病毒病，造成更嚴(yán)重?fù)p失。目前，隨著人們對(duì)農(nóng)藥殘留、食品及環(huán)境安全的關(guān)注及西花薊馬抗藥性的產(chǎn)生，生物防治在西花薊馬防治中的地位越來(lái)越重要。球孢白僵菌Be

2、auveria bassiana作為一種安全無(wú)污染的蟲(chóng)生真菌，對(duì)西花薊馬具有良好的防治效果，已被開(kāi)發(fā)成多種劑型用于西花薊馬的田間防治。本研究主要以球孢白僵菌菌株XJWLMQ-32為供試菌株，對(duì)球孢白僵菌液固雙相發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，利用4種方法對(duì)已退化的菌株進(jìn)行復(fù)壯試驗(yàn)，通過(guò)比較菌株的產(chǎn)孢量和毒力，篩選出一種最有效的復(fù)壯方法，然后對(duì)菌株的液體搖瓶發(fā)酵和固體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定液固雙相發(fā)酵的最佳生產(chǎn)工藝，最后利用7L發(fā)酵罐對(duì)菌株進(jìn)

3、行放大培養(yǎng)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵罐的條件參數(shù)，提高發(fā)酵液的質(zhì)量，進(jìn)而促進(jìn)菌株固體產(chǎn)孢，為菌株的規(guī)?；a(chǎn)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　室內(nèi)篩選的對(duì)西花薊馬具有高效致病力的球孢白僵菌菌株XJWLMQ-32，在固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)8代后菌株退化十分嚴(yán)重。采用4種不同的方法對(duì)第8代退化菌株進(jìn)行復(fù)壯試驗(yàn)。結(jié)果顯示，連續(xù)復(fù)壯5代后，利用西花薊馬蟲(chóng)體粉培養(yǎng)基復(fù)壯的菌株產(chǎn)孢能力和毒力恢復(fù)效果最好，產(chǎn)孢量為9.11×108個(gè)/cm2，LT5

4、0為2.87 d，西花薊馬第5天的累積校正死亡率高于90％；利用膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基復(fù)壯后，菌株的LT50為3.12 d，每代菌株毒力的提升率適中且穩(wěn)定；蠶蛹粉復(fù)壯后，菌株產(chǎn)孢量最高，但毒力的提升率最低且波動(dòng)較大；利用蟬蛻培養(yǎng)基復(fù)壯，菌株產(chǎn)孢和毒力的恢復(fù)效果較差。在產(chǎn)孢培養(yǎng)基中同時(shí)添加西花薊馬蟲(chóng)體粉和膠體幾丁質(zhì)，其毒力和產(chǎn)孢能力的恢復(fù)效果好且穩(wěn)定，毒力恢復(fù)比例由13.39%降為11.45%，產(chǎn)孢量提高比例由40.93%降低為34.66%，僅

5、下降6.27%。綜合考慮，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基中同時(shí)添加適量的蟲(chóng)體粉和膠體幾丁質(zhì)對(duì)退化菌株的產(chǎn)孢和毒力恢復(fù)效果好且穩(wěn)定。
　　采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法對(duì)菌株液體搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、裝樣量、轉(zhuǎn)速和濃度是影響發(fā)酵生物量的主要因素，一定范圍內(nèi)的pH變化對(duì)此菌株的液體發(fā)酵影響較小。在自然pH下，當(dāng)培養(yǎng)溫度27.08℃、裝樣49.72 mL（250 mL三角瓶）、搖床轉(zhuǎn)速205.45 r/min、

6、接種濃度1.122×107孢子/mL時(shí)，發(fā)酵48h產(chǎn)生的生物量最大。在優(yōu)化發(fā)酵條件下進(jìn)行液固雙相發(fā)酵試驗(yàn)，得到的球孢白僵菌液體發(fā)酵生物量為14.769g/L，與模型預(yù)測(cè)生物量相符，固體發(fā)酵后產(chǎn)孢量為20.16g/kg，含孢量1.84×1011孢子/g。
　　以菌株的產(chǎn)孢數(shù)為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的方法對(duì)菌株固體發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行篩選，并對(duì)其固體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，使用麥麩和稻殼作為固體發(fā)酵基質(zhì)，在基質(zhì)中添加0.3%KH2

7、PO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.1%NH4NO3混勻，保持麥稻比為4:1，料水比為3:1，發(fā)酵液接種量為30%，使用15cm×30cm的保鮮袋裝料，置于26℃培養(yǎng)箱前3 d黑暗封閉培養(yǎng)，后5d光照開(kāi)袋培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為2500lx）。通過(guò)此培養(yǎng)方法得到菌株的產(chǎn)孢數(shù)高達(dá)(18.30±1.58)×109個(gè)/g，顯著高于優(yōu)化前菌株的產(chǎn)孢數(shù)。
　　以發(fā)酵液中菌株的生物量為指標(biāo)，優(yōu)化7L發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù)，對(duì)菌株XJWLMQ-32進(jìn)行放