2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩122頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、結(jié)核病是一種古老的細(xì)菌性疫病,是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染或者長期潛伏引起的嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康的傳染病。在世界范圍內(nèi),大約有二十億人潛伏感染了結(jié)核分枝桿菌,造成了每年約兩百萬人的死亡,它仍然是引起發(fā)病率和死亡率的主要病原。
  2012年Eui-H ong Byun等人將結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白通過液相色譜法分離并收集,并用不同管數(shù)的蛋白處理DC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Rv0315蛋白可以通過激活

2、NF-κB信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路顯著性的誘導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟,是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的潛在的免疫性抗原。
  為了解決結(jié)核分枝桿菌的耐藥性以及市場上現(xiàn)有疫苗效果的局限性這一現(xiàn)狀,我們需要探究新的結(jié)核疫苗候選分子的一些特性,因此開展了關(guān)于Rv0315的結(jié)構(gòu)和功能的研究。利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)平臺(tái)我們首次解析了Rv0315的三維結(jié)構(gòu),并對它的功能以及發(fā)揮功能的機(jī)制進(jìn)行了研究和探討。具體研究內(nèi)容如下:
  Rv0315屬于β-1,3葡聚糖酶家族

3、。β-1,3葡聚糖酶屬于糖苷水解酶16家族,他們具有序列和結(jié)構(gòu)的同源性?;谶@個(gè)共性,我們首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中將目前已知結(jié)構(gòu)和功能的所有β-1,3葡聚糖酶的氨基酸序列導(dǎo)出,并將它們與Rv0315一起做了氨基酸的多序列比對,Rv0315在序列上展示出與β-1,3葡聚糖酶較高的序列同源性,保守的兩個(gè)谷氨酸催化位點(diǎn)以及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)都是存在的。通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)Rv0315屬于β-1,3葡聚糖酶家族。
  GH16家族的β-1,3葡

4、聚糖酶還有一個(gè)特點(diǎn)就是結(jié)構(gòu)的同源性也很高,基于β-1,3葡聚糖酶家族的這個(gè)共性,我們首先構(gòu)建了H37Rv株Rv0315全長的表達(dá)質(zhì)粒pET42b-Rv0315,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了可溶性表達(dá)的蛋白。通過實(shí)驗(yàn)室已有的晶體篩選試劑盒篩選和優(yōu)化得到一個(gè)分辨率達(dá)1.7(A)的晶體,收集數(shù)據(jù)并通過分子置換的方法解析了Rv0315的結(jié)構(gòu)。由Rv0315的結(jié)構(gòu)可以看出它符合β-1,3葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)特征,包括16個(gè)β折疊形成的兩個(gè)β片層,β片層彎

5、曲形成一個(gè)凹面,是一個(gè)催化活性中心;兩個(gè)較短的α螺旋和一個(gè)鈣離子。通過以上從序列和結(jié)構(gòu)上分析,我們發(fā)現(xiàn)Rv0315是一個(gè)β-1,3葡聚糖酶。
  Rv0315是一個(gè)沒有活性的β-1,3葡聚糖酶。細(xì)菌產(chǎn)生的β-1,3葡聚糖酶都屬于糖苷水解酶16家族,所有的β-1,3葡聚糖酶都可以水解β-1,3糖苷鍵的糖,例如昆布多糖,少部分也可以水解β-1,3-1,4糖苷鍵的糖,例如大麥來源的β葡聚糖。Rv0315是一個(gè)β-1,3葡聚糖酶,所以我們

6、通過DNS實(shí)驗(yàn)測定了其對昆布多糖以及大麥來源的β葡聚糖的水解活性。奇怪的是,Rv0315既不能降解昆布多糖,同時(shí)對大麥來源的β葡聚糖也沒有可檢測到的水解活性。從以上結(jié)果可知,Rv0315是一個(gè)沒有活性的β-1,3葡聚糖酶。我們將目前已知結(jié)構(gòu)和功能的GH16家族的β-1,3葡聚糖酶做了進(jìn)化樹分析,結(jié)果顯示Rv0315與海魚分枝桿菌的β-1,3葡聚糖酶(PDB號(hào)4PQ9)形成了一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支。4PQ9的結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析,功能沒有相關(guān)的報(bào)道,

7、相關(guān)文章對該基因的標(biāo)注是β-1,3葡聚糖酶。我們合成了4PQ9基因并成功獲得了可溶性的蛋白,我們利用同樣的方法檢測了4PQ9的水解活性,結(jié)果表明4PQ9也是一個(gè)沒有活性的β-1,3葡聚糖酶。我們發(fā)現(xiàn)了GH16家族β-1,3葡聚糖酶中一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支,這個(gè)分支是由兩個(gè)沒有活性的β-1,3葡聚糖酶組成。
  Rv0315沒有多糖水解活性的分子機(jī)制。我們通過比對Rv0315與海洋細(xì)菌的β-1,3葡聚糖酶(PDB號(hào)4BOW)的結(jié)構(gòu)來解釋

8、Rv0315沒有水解活性的機(jī)制。4BOW對昆布多糖有很高的催化活性,同時(shí)也可以水解MLG。MLG是一種β-1,3-1,4葡聚糖,跟大麥來源的β葡聚糖相似。通過結(jié)構(gòu)比較我們發(fā)現(xiàn),4BOW中-2位以及-3位跟多糖結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基在GH16家族β-1,3葡聚糖酶中都是保守的,但Rv0315中都是缺失或者突變的,而-1位的跟葡萄糖單位結(jié)合的氨基酸在Rv0315中也是保守的。所以,目前所知道的Rv0315唯一可以結(jié)合的分子就是乙二醇。乙二醇分

9、子是在Rv0315結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的,結(jié)合的位置跟-1位的葡萄糖單位所在的位置類似。從整體結(jié)構(gòu)比較可以看出,Rv0315的催化裂開口很大。由結(jié)構(gòu)比較的結(jié)果可以看出Rv0315由于結(jié)合底物相關(guān)的氨基酸的缺失或者突變使其催化裂的開口較大,導(dǎo)致Rv0315不能結(jié)合多糖進(jìn)而不能水解多糖。我們通過ITC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Rv0315確實(shí)不能結(jié)合昆布多糖,而4BOW-E269S可以結(jié)合多糖并呈現(xiàn)很好的擬合曲線。一個(gè)昆布多糖分子可以結(jié)合兩個(gè)4BOW-E269S分子

10、。
  Rv0315的結(jié)構(gòu)與其發(fā)揮免疫學(xué)功能的關(guān)系。Rv0315雖然是一個(gè)沒有活性的β-1,3葡聚糖酶,但其兩個(gè)擔(dān)當(dāng)催化作用的谷氨酸位點(diǎn)還是存在的。Rv0315可能在長期進(jìn)化過程中失去水解多糖的功能進(jìn)而參與發(fā)揮免疫學(xué)功能。因?yàn)镽v0315開口比較大,當(dāng)結(jié)核分枝桿菌入侵機(jī)體時(shí)可能更容易暴露而受到免疫相關(guān)分子的攻擊,因此參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。為了驗(yàn)證我們的推測,我們通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來檢測Rv0315以及突變體Rv0315E176S、

11、Rv0315D289A對NF-κB信號(hào)通路的激活情況,Rv0315以及Rv0315D289A可以激活NF-κB信號(hào)通路并且呈劑量依賴性。而催化活性位點(diǎn)176位的突變體則不能激活NF-κB信號(hào)通路。此外,我們還用不同濃度的Rv0315以及突變體蛋白處理DC細(xì)胞,檢測它們誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的能力,結(jié)果跟熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同,Rv0315和Rv0315D289A可以誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟,而Rv0315E176S則不能誘導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟。

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論