豬場(chǎng)廢棄物堆肥微生物多樣性及空間異質(zhì)性的研究.pdf

1、規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展為豐富居民菜籃子工程作出了重大貢獻(xiàn)，同時(shí)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)糞便的大量集中排放給環(huán)境造成了巨大壓力。堆肥技術(shù)起源較早，通常用于有機(jī)固體廢棄物的資源化利用，是實(shí)現(xiàn)養(yǎng)豬業(yè)與環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展的有效途徑之一。堆肥的實(shí)質(zhì)是微生物的代謝作用。而且，堆肥微生物多樣性的研究是近年來的熱點(diǎn)。研究表明，當(dāng)前采用的強(qiáng)制通風(fēng)好氧堆肥系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致物料中存在“梯度效應(yīng)”，但是其產(chǎn)生的微生物學(xué)機(jī)理還不得而知。由于溫度是控制微生物群落結(jié)構(gòu)組成的關(guān)鍵因素之一，因

2、此，在“梯度效應(yīng)”存在的情況下微生物的空間分布應(yīng)具有異質(zhì)性。因而，本研究應(yīng)用16SrRNA基因作為分子標(biāo)記，對(duì)豬糞堆肥過程中升溫期、高溫期和降溫期的上、中、下三層共9個(gè)堆肥樣品中的細(xì)菌群落組成及多樣性進(jìn)行了深入研究，并采用變性梯度凝膠技術(shù)對(duì)9個(gè)堆肥樣品的細(xì)菌區(qū)系變化進(jìn)行了檢測(cè)。具體結(jié)果如下：1．堆肥試驗(yàn)
　　 利用強(qiáng)制通風(fēng)靜態(tài)倉堆肥系統(tǒng)進(jìn)行了豬場(chǎng)廢棄物堆肥試驗(yàn)，物料碳氮比調(diào)整為20，起始含水率為65％，堆肥過程歷經(jīng)快速升溫期、持

3、續(xù)高溫期和降溫期三個(gè)典型階段，堆制結(jié)束時(shí)，堆體體積減少了41.67%。堆體溫度在40h達(dá)到50℃，并在60℃以上維持10d，蛔蟲卵殺滅率和大腸桿菌值分別為100%和0.062，達(dá)到國家糞便無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的必要條件。整個(gè)堆肥過程歷時(shí)53d。堆肥試驗(yàn)取得成功，為后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)。2．核酸的提取
　　 參照Holben(1994)提供的改良方法，對(duì)堆肥過程中升溫期、高溫期和降溫期上、中、下三層共9個(gè)堆肥樣品進(jìn)行了微生物的分離、細(xì)

4、胞破碎和基因組DNA的提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片斷大小在15Kb以上。采用DNA/RNA濃度測(cè)定儀，測(cè)得的A260/A280的比值在1.6-1.8之間，濃度為350ng/μL左右。結(jié)果表明，采用本方法提取、純化獲得的核酸結(jié)果較好，能夠滿足后面的PCR、克隆等分子生物學(xué)研究的需要。
　　 3．基于16SrRNA分子標(biāo)記的分子生物學(xué)分析
　　 (1)將測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Clustalw程序進(jìn)行序列比對(duì)，堆肥升溫期的上、中、下三層分

5、別被分為33、56和32個(gè)序列型；高溫期的上、中、下三層分別被分為48、46和44個(gè)序列型；降溫期的上、中、下三層分別被分為48、26和35個(gè)序列型。
　　 (2)溫度是影響堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)組成的關(guān)鍵因素之一。
　　 (3)整個(gè)堆肥過程中，在有效分析的1158個(gè)克隆子中，總共有357個(gè)序列型，約87.4%的序列型歸到Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria(包括α-Proteoba

6、cteria、B-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和δ-Proteobacteria)、Actinobacteria這4個(gè)類群中，相應(yīng)克隆子所占的比例分別是70.6%、1.47%、15.11%、3.80%。另外占全部克隆子數(shù)約9%的44個(gè)序列型則和Genbank數(shù)據(jù)庫中的純培養(yǎng)菌無任何相似性。
　　 (4)堆肥初期Shigella、Clostridium等占優(yōu)勢(shì)；高溫期Bacillus、Clostr

7、idium、Ureibacillus thermosphaericus等占優(yōu)勢(shì)；降溫期Thermobifida fusca、Clostridium等占優(yōu)勢(shì)；而在整個(gè)堆肥化過程中Clostr idium都是優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　 (5)發(fā)現(xiàn)了44條未培養(yǎng)菌的序列，與已知菌的序列無任何相似性，但和GenBank中的已知序列有高度相似性。而這些新的序列或可能是新的物種，它們?cè)诙逊蔬^程中究竟起到什么作用，都是值得我們進(jìn)一步研究的問題，它們?cè)诓?/p>

8、久的將來很可能成為人類可開發(fā)和可利用的堆肥微生物資源。我們所獲得的這些新序列填補(bǔ)了國內(nèi)這方面的不足，為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供了寶貴的科研資料。
　　 (6)獲得了368條堆肥微生物的16S rDNA序列，并提交到了歐洲核酸序列數(shù)據(jù)庫（European Molecular Biology Laboratory, EMBL），獲得登陸號(hào)：AM182993-AM183113, AM500715-AM500852, AM930270-AM

9、930378。4．PCR-DGGE分析
　　 (1)PCR-DGGE分析結(jié)果顯示，豬場(chǎng)廢棄物堆肥過程中不同時(shí)期、不同高度層樣品中有著比較豐富的細(xì)菌多樣性，同時(shí)存在明顯的優(yōu)勢(shì)種群結(jié)構(gòu)變化。PCR-DGGE圖譜中主要的優(yōu)勢(shì)性條帶都達(dá)到或接近10條以上，加上微弱的條帶會(huì)更多，表明豬場(chǎng)廢棄物堆肥過程中如此豐富的微生物是潛在的寶貴資源。
　　 (2)通過Cs值分析結(jié)果顯示，整個(gè)降溫期3個(gè)樣品之間的相似性相對(duì)更高些，說明降溫期3層樣