Arthrobacter ureafaciens CZ31氨氮降解特性及氨同化關(guān)鍵酶的研究.pdf

1、過(guò)量的氨氮流入河流湖泊會(huì)引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，并對(duì)公眾健康造成威脅。物理化學(xué)法處理氨氮廢水往往成本過(guò)高，而且會(huì)產(chǎn)生有毒的物質(zhì)和殘留物。近年來(lái)，利用微生物的硝化與反硝化作用去除氨氮獲得越來(lái)越多的重視。
　　Arthrobacter ureafaciens CZ31是本實(shí)驗(yàn)室從被工業(yè)廢水污染的土壤中篩選得到的高效降解吡啶和氨氮的菌株。研究A.ureafaciens CZ31氨氮降解性能發(fā)現(xiàn)，氨氮初始濃度和碳氮比對(duì)菌株降解氨氮的效果影響較大

2、，氨氮初始濃度為2.62g/L時(shí)，菌株降解氨氮速率最高，達(dá)0.104g·L-1·h-1;碳氮比為20∶1時(shí)，菌株氨氮降解率最高，達(dá)70.08％;接種量和pH影響較小，不同情況下的降解率相差不大。A.ureafaciens CZ31氨同化作用的主要酶有谷氨酰胺合成酶(GS)、丙氨酸脫氫酶(AlaDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)，其酶學(xué)特性的研究結(jié)果表明，GS酶活基本不受培養(yǎng)條件的影響，且酶活水平很低;高濃度氨氮時(shí)，GDH和AlaDH酶活提高

3、，AlaDH酶活有顯著提升，為探究氨離子對(duì)AlaDH酶活的影響在蛋白水平還是轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)AlaDH進(jìn)行異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　在NCBI上查找同菌屬AlaDH的基因序列，提取A.ureafaciens CZ31基因組，設(shè)計(jì)引物后PCR擴(kuò)增得到ald基因，連接至T載體并測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)該基因全長(zhǎng)1119bp，編碼372個(gè)氨基酸。蛋白建模得出AlaDH蛋白包含六個(gè)亞基，其理論分子量大約為40kDa。亞克隆至質(zhì)粒pET-28a得到重組

4、質(zhì)粒pET-28a-ald，轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta，IPTG誘導(dǎo)后對(duì)重組酶進(jìn)行酶活檢測(cè)，比活為2.65U/mg。研究溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)工程菌產(chǎn)酶的影響，并在單因素分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果顯示，搖瓶發(fā)酵的最佳條件為:溫度22℃、IPTG0.7mM、誘導(dǎo)時(shí)間8h。在此條件下，比活為15.23U/mg，是初始比活的5.75倍。各因素對(duì)酶活的影響強(qiáng)度為IPTG濃度＞溫度＞溫度×IPTG濃度＞溫度×誘導(dǎo)時(shí)間＞IPT

5、G濃度×誘導(dǎo)時(shí)間＞誘導(dǎo)時(shí)間。
　　對(duì)鎳柱純化后的重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，重組酶最適溫度為30℃;最適pH為7;重組酶在0-30℃保溫2h后，酶活保留80％，溫度穩(wěn)定性較好;Ca2+對(duì)酶活力具有促進(jìn)作用，Mg2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+對(duì)AlaDH的活力均有抑制作用，Zn2+無(wú)明顯作用;不同氨離子濃度下酶活無(wú)明顯變化。由此推測(cè)氨離子對(duì)A.ureafaciens CZ31丙氨酸脫氫酶的促進(jìn)作用在轉(zhuǎn)錄水平。查找同源菌株丙氨酸脫

6、氫酶上游序列發(fā)現(xiàn)了PucR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，設(shè)計(jì)引物PCR得到該基因，并將其連接至pMD-18T進(jìn)行測(cè)序，蛋白建模發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白具有兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基均含一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)其中一個(gè)是氨離子結(jié)合位點(diǎn)。
　　A.ureafaciens CZ31能夠高效快捷的降解吡啶和氨氮，對(duì)其降解條件探究后能夠更好的用于實(shí)際廢水的處理。探究氨離子對(duì)A.ureafaciens CZ31丙氨酸脫氫酶的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了來(lái)自PucR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，為