基于免標(biāo)記熒光生物傳感器檢測(cè)蛋白質(zhì)和小分子的研究.pdf

1、生物傳感技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)諸如設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、響應(yīng)速度快和靈敏度高等，已經(jīng)在分析化學(xué)、生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)等領(lǐng)域中引起了人們的高度關(guān)注。其中，利用熒光信號(hào)作為檢測(cè)手段的熒光生物傳感器在基因測(cè)序、環(huán)境監(jiān)測(cè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了廣大科研工作者的廣泛興趣。蛋白質(zhì)和小分子的檢測(cè)對(duì)疾病診斷、營(yíng)養(yǎng)健康分析及臨床研究具有十分重要的意義。因此，對(duì)蛋白質(zhì)和小分子等人體內(nèi)物質(zhì)的分析一直是現(xiàn)代分析化學(xué)非常重要的研究課題。如何利用熒光生物傳感技術(shù)實(shí)

2、現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和小分子快速、靈敏和精確的檢測(cè)仍是生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)工作者的追求。本文基于當(dāng)前的研究現(xiàn)狀，結(jié)合信號(hào)放大技術(shù)，使用熒光染料作為標(biāo)記物發(fā)展了一些新的熒光生物傳感技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)和小分子的高靈敏檢測(cè)，研究?jī)?nèi)容具體如下:
　　1.基于酶催化目標(biāo)物循環(huán)放大誘導(dǎo)發(fā)卡適體結(jié)構(gòu)的改變構(gòu)建免標(biāo)記熒光傳感器靈敏檢測(cè)ATP在本實(shí)驗(yàn)中，我們展示了一個(gè)新的免標(biāo)記、簡(jiǎn)單靈敏的熒光ATP檢測(cè)傳感器，該方法是基于核酸外切酶Ⅲ(Ⅲ酶)催化的目標(biāo)物循環(huán)

3、放大(ECTR)策略，利用SYBR GreenⅠ作為熒光指示劑，在ATP存在時(shí)，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的適體鏈構(gòu)型發(fā)生改變構(gòu)建成新的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該新構(gòu)型將被Ⅲ酶水解，同時(shí)釋放出的目標(biāo)物ATP引發(fā)下一個(gè)循環(huán)。如此目標(biāo)物循環(huán)過程將水解大量的發(fā)夾結(jié)構(gòu)適體探針，導(dǎo)致發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖部中SYBR GreenⅠ嵌入量的減少，熒光發(fā)射強(qiáng)度的急劇減少。該方法用于ATP的靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)限可低至納摩爾級(jí)別。由于ATP和適體之間高效特異的親和力，該方法對(duì)于ATP的類似物分子展示

4、了非常好的選擇性。此外，該ATP檢測(cè)方案簡(jiǎn)單穩(wěn)定，不需要標(biāo)記適體探針，并且適用于均相檢測(cè)，使得其在檢測(cè)其他小分子方面具有很大的應(yīng)用潛能。
　　2.基于小分子鏈接單鏈DNA的終端保護(hù)用于免標(biāo)記熒光檢測(cè)葉酸受體在這個(gè)工作中，基于葉酸連接單鏈DNA的終端保護(hù)和熒光染料SYBR Gold，我們發(fā)展了一種免標(biāo)記的熒光方法用于檢測(cè)葉酸受體。目標(biāo)物葉酸受體和連接葉酸的單鏈DNA的結(jié)合可以保護(hù)該單鏈DNA不被核酸外切酶Ⅰ（Ⅰ酶）水解。受終端保護(hù)沒

5、有被水解的單鏈DNA與熒光染料SYBR Gold結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，基于此檢測(cè)葉酸受體，檢測(cè)限能達(dá)到30pM。此外，該方法也展示了良好的選擇性，且避免了DNA探針的熒光標(biāo)記。在以上優(yōu)點(diǎn)的驅(qū)動(dòng)下，通過使用不同的小分子配體和蛋白質(zhì)受體，該方法在檢測(cè)其他蛋白質(zhì)方面具有很大的應(yīng)用潛能。
　　3.基于Toehold鏈置換引發(fā)G-四鏈體DNA組裝的非酶免標(biāo)記熒光檢測(cè)凝血酶基于一種新的信號(hào)放大技術(shù)即toehold鏈置換引發(fā)G-四鏈體DNA循環(huán)組

6、裝，我們發(fā)展了一種免標(biāo)記的非酶?jìng)鞲衅饔糜诟哽`敏的熒光檢測(cè)凝血酶。目標(biāo)物凝血酶能夠和其相應(yīng)的適體結(jié)合并且釋放出作為引發(fā)序列的單鏈DNA，該引發(fā)序列能夠引發(fā)兩端含有封閉G-四鏈體結(jié)構(gòu)的發(fā)夾探針的toehold鏈置換，導(dǎo)致DNA組裝，且兩端形成G四鏈體結(jié)構(gòu)。toehold鏈置換的反應(yīng)導(dǎo)致引發(fā)序列的循環(huán)再使用并且產(chǎn)生許多含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA雙鏈。熒光染料NMM能夠特異性的和G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合并且釋放出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍浅ｌ`敏