基于氧化石墨烯的熒光生物傳感新方法研究.pdf

1、生物分子的快速靈敏檢測一直以來都是生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的課題。現(xiàn)代社會的快速發(fā)展對生物傳感技術(shù)提出了更高的要求，發(fā)展新的分析方法和技術(shù)以應(yīng)對越來越多的分析難題和社會熱點問題為分析化學(xué)工作者提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。熒光生物傳感技術(shù)具有靈敏度高和響應(yīng)速度快等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各種生物分子的檢測，包括蛋白質(zhì)、生物小分子、核酸和酶活性等。傳統(tǒng)的熒光生物傳感技術(shù)往往需要多重?zé)晒鈽擞浐鸵幌盗械姆糯蠓椒▉硖岣哽`敏度，從而增加了檢測的成本和實驗的復(fù)

2、雜性。另外，傳統(tǒng)的熒光傳感技術(shù)還存在較高背景熒光的干擾。因此進一步改進和發(fā)展新的熒光傳感技術(shù)，以提高生物分析的性能和降低檢測的成本有十分重要的意義。
　　 氧化石墨烯(GO)由于其獨特的DNA吸附性能和通用型熒光淬滅劑的性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測?；贕O的熒光傳感器與傳統(tǒng)熒光傳感器相比有諸多優(yōu)勢，例如改進了檢測靈敏度、降低了檢測成本和增大了信背比等，這表明基于GO的熒光傳感器在生物分子檢測方面有很大的應(yīng)用前景。這類傳感器

3、大多依賴GO能強烈吸附熒光染料標記的單鏈DNA同時淬滅其熒光，目標物與熒光單鏈DNA結(jié)合使其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，進而使熒光染料與GO距離拉大，熒光恢復(fù)，從而實現(xiàn)對目標物的檢測。但是這類傳感器的檢測限一般有限且需要熒光標記，有待進一步改進。將DNA嵌入染料與GO相結(jié)合進行生物分子檢測已有報道，其檢測性能顯著改善，我們推斷此類非標熒光傳感器有望在生物分子檢測中得到廣泛應(yīng)用。
　　 本論文針對以上問題，在綜合文獻報道的基礎(chǔ)之上，基于GO獨特的D

4、NA吸附和熒光染料淬滅性能發(fā)展了一系列簡單、快速、靈敏的熒光生物傳感新方法用于DNA酶活性、核酸和三磷酸腺苷(ATP)等生物分子的檢測，具體內(nèi)容如下:
　　 第2章中，基于發(fā)夾引物和聚合延伸，結(jié)合GO獨特的DNA吸附和通用型熒光淬滅性能發(fā)展了一種新型非標熒光檢測方法用于DNA3’磷酸酶的檢測及其抑制劑的定量表征。本實驗設(shè)計了一條3’磷酸化的DNA發(fā)夾引物，只有經(jīng)DNA3’磷酸酶的去磷酸作用后，發(fā)夾引物才能發(fā)生聚合延伸生成雙鏈DN

5、A產(chǎn)物。由于GO與雙鏈DNA的結(jié)合力較弱不能有效淬滅染色雙鏈產(chǎn)物的熒光，因此得到較強的熒光信號。無DNA3’磷酸酶時，發(fā)夾引物不能去磷酸化引發(fā)聚合延伸，進而被GO吸附淬滅，得到較弱的背景信號，從而實現(xiàn)對目標DNA3’磷酸酶的靈敏檢測。該方法可實現(xiàn)對兩種DNA3’磷酸酶(T4多聚核苷酸激酶和小蝦堿性磷酸酶)活性的同時檢測，檢測限分別為0.07 U/mL和0.003 U/mL。另外，該方法不僅可以對DNA3'磷酸酶的抑制劑進行定量表征，還適

6、用于復(fù)雜生物環(huán)境中目標物的測定。本方法設(shè)計簡單、操作方便、靈敏度高且選擇性好，有望成為DNA3’磷酸酶檢測的一種很好的選擇并能應(yīng)用于DNA損傷修復(fù)機理的研究。
　　 第3章中，基于等溫循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)(ICSDPR)和DNA嵌入染料的光學(xué)特性，結(jié)合GO獨特的吸附和淬滅性能發(fā)展了一種非標放大熒光DNA檢測方法。實驗設(shè)計了一條3’磷酸化的發(fā)夾探針，只有加入目標DNA與發(fā)夾雜交引發(fā)其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，引物才能與發(fā)夾打開的莖端雜交，然后在聚合

7、酶作用下發(fā)生ICSDPR。經(jīng)過多步的循環(huán)放大，產(chǎn)生大量的雙鏈DNA產(chǎn)物，進而得到放大的熒光信號。無目標DNA時，發(fā)夾探針不能發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變和ICSDPR，經(jīng)SYBR GreenⅠ(SG)染色和GO吸附后，生成較低的背景信號，從而實現(xiàn)對目標DNA的放大熒光檢測。該方法首次提出在GO平臺上結(jié)合SG和ICSDPR放大檢測DNA，有較寬的線性范圍和高選擇性，檢測限為4 pM，跟基于GO的均相DNA檢測相比有明顯優(yōu)勢。該方法設(shè)計簡單、方便經(jīng)濟，有望

8、成為DNA靈敏檢測的一種常用方法。
　　 第4章中，基于ATP依賴的DNA連接反應(yīng)和GO獨特的吸附和淬滅性能，發(fā)展了一種高靈敏的ATP檢測新方法。實驗設(shè)計的三種DNA探針退火雜交形成帶有單鏈缺口的熒光雙鏈DNA，在輔助因子ATP和T4 DNA連接酶同時存在下，缺口被連接形成完整的雙鏈DNA。連接產(chǎn)物有較高的熔鏈溫度能在實驗加熱條件下保持雙鏈結(jié)構(gòu)，不被GO有效淬滅，得到較強的熒光信號。無ATP時，DNA連接反應(yīng)不能發(fā)生，三鏈退火的

9、復(fù)合物在實驗加熱條件下解鏈進而被GO吸附，熒光淬滅，從而實現(xiàn)對目標ATP的靈敏檢測。該方法簡單快速、靈敏度高選擇性好，檢測限達0.3 nM，跟大多數(shù)無放大的均相ATP適配體傳感方法相比有明顯優(yōu)勢，跟電化學(xué)適配體方法的檢測限有可比性。該方法具有高選擇性，不僅能使ATP從其它三磷酸核苷中分離開來，還可使ATP與其同系物區(qū)分開來。
　　 第5章中，基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)對酶切底物的選擇性和GO對單雙鏈DNA結(jié)合力的差別發(fā)展了一種

10、非標熒光ATP檢測方法。實驗設(shè)計的5’磷酸化的發(fā)夾探針能跟互補DNA退火雜交形成帶單鏈缺口的雙鏈DNA產(chǎn)物。在輔助因子ATP和連接酶同時存在時，缺口被連接形成完整的長莖端發(fā)夾產(chǎn)物，且靠近3’端的堿基硫代處理。這種發(fā)夾產(chǎn)物不能被ExoⅢ酶切，經(jīng)SG染色和GO混合后，得到顯著的熒光信號。無ATP時，缺口不能被連接進而被ExoⅢ酶切，互補DNA被降解同時釋放發(fā)夾探針，染色后的發(fā)夾被GO吸附淬滅，生成較低的背景信號，從而實現(xiàn)對目標ATP的靈敏檢

11、測。該方法設(shè)計巧妙新穎，有較高的靈敏度和選擇性，檢測限達0.2 nM。
　　 第6章中，基于限制性核酸內(nèi)切酶酶切的特異性和GO對不同的DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合力大小的差別發(fā)展了一種新型熒光方法用于檢測核酸內(nèi)切酶的活性及其抑制劑。我們設(shè)計了一條單標記熒光發(fā)夾探針，發(fā)夾的莖端序列包含有內(nèi)切酶的識別位點。當(dāng)目標內(nèi)切酶存在時，發(fā)夾探針被酶切成三部分，其中帶熒光染料的DNA短片段與GO結(jié)合力較小而游離到溶液中，生成較強的熒光信號。無目標內(nèi)切酶時，發(fā)