膠原受體DDR2在頭頸部鱗癌中的作用研究.pdf

1、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)在全世界范圍內(nèi)每年約有500萬病例被確診,約占全部腫瘤病例的6％。在過去的20年里,隨著診斷、外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療技術(shù)水平的提高以及治療方案的成熟,頭頸部鱗癌患者的死亡率已有所降低,但其5年生存率仍僅有40%-50%。術(shù)后高復(fù)發(fā)率及高轉(zhuǎn)移率是影響頭頸部鱗癌患者生存率最主要的兩個(gè)因素。因此,研究頭頸部鱗癌轉(zhuǎn)移中相關(guān)的信號(hào)

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將有助于提高對(duì)本病的治療。
　　DDR2(Discoidin domain receptor2)是一種受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase, RTK),可以被多種膠原激活(I-III型)。DDR2特異性的參與一系列腫瘤生物學(xué)行為,包括調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是DDR2通路中一組主要的

3、下游靶基因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)在頭頸部鱗癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,它主要通過促進(jìn)原發(fā)性腫瘤細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,減弱細(xì)胞與細(xì)胞間連接,從而有助于細(xì)胞穿透各種屏障而加速腫瘤的侵襲和遷移,而 DDR2是一種調(diào)控 EMT的關(guān)鍵性因素。因此我們推測(cè) DDR2可能是一個(gè)新的癌基因。至今為止有關(guān) DDR2在頭頸部鱗癌中相關(guān)功能的研究未見明確報(bào)道,本研究目的與意義是探討DDR2基因在頭頸部鱗癌發(fā)病機(jī)制中的作用,確定 DDR2基因的功能,為頭頸部鱗癌的防

4、治提供理論依據(jù)。
　　為了明確 DDR2在頭頸部鱗癌中的作用,我們首先檢測(cè)了DDR2在頭頸部鱗癌及癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示癌組織標(biāo)本中 DDR2的mRNA表達(dá)量明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織,并隨著腫瘤等級(jí)的升高而升高。通過免疫組化及免疫印跡技術(shù),我們觀察到了相同的結(jié)果。在免疫組化結(jié)果中,DDR2表達(dá)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度與患者腫瘤等級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),與患者年齡和性別無關(guān)。上述結(jié)果強(qiáng)烈提示我們?cè)陬^頸部鱗癌中,DDR2可能是

5、一種高等級(jí)及高轉(zhuǎn)移鱗癌的標(biāo)記物。
　　臨床證據(jù)顯示高等級(jí) HNSCC在獲得高轉(zhuǎn)移潛能時(shí)往往伴隨著 E-cadherin的表達(dá)喪失及 vimentin的表達(dá)上升。因此,我們選取四種 HNSCC細(xì)胞系 Tca8113、TB cells、SCC25和FaDu,同時(shí)運(yùn)用qPCR及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)其E-cadherin和vimentin的表達(dá),結(jié)果顯示相對(duì)于 Tca8113及 TB細(xì)胞,SCC25和FaDu細(xì)胞高表達(dá) E-cadherin,

6、而 vimentin幾乎不表達(dá)。這與上述細(xì)胞之前的報(bào)道相吻合,提示Tca8113及 TB細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移特性,而 SCC25和FaDu細(xì)胞則傾向于上皮樣細(xì)胞。與此同時(shí),DDR2表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示其在 Tca8113及 TB細(xì)胞中明顯高于SCC25和FaDu細(xì)胞,提示 DDR2與 HNSCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能具有直接相關(guān)性。
　　為了全面理解 DDR2在 HNSCC細(xì)胞系生物學(xué)行為中的作用,我們通過外源性腺病毒過表達(dá) DDR2來觀測(cè)其對(duì)

7、細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。MTT細(xì)胞生長曲線、EdU測(cè)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期結(jié)果均顯示無明顯差別。Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2明顯促進(jìn)了HNSCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并且在細(xì)胞予以 I型膠原幾次后,這種作用被明顯放大。鑒于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)主要依靠 MMP2和MMP9的分泌水平,我們運(yùn)用免疫印跡檢測(cè)兩者的表達(dá)水平,結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2顯著提高了MMP2和MMP9的表達(dá)水平。同時(shí),我們通過小干擾 RNA技術(shù)沉默DDR2在

8、高表達(dá)內(nèi)源性 DDR2的TB細(xì)胞中重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,DDR2沉默后明顯降低了TB細(xì)胞的侵襲和遷移力。通過上述結(jié)果,我們可以假設(shè) DDR2在HNSCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能主要為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　在腫瘤發(fā)展過程中,EMT主要參與腫瘤細(xì)胞局部侵襲、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)顯示 DDR2是一種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物以及 EMT的關(guān)鍵性調(diào)控因子。這些確定的理論促使我們?nèi)ゴ_認(rèn) DDR2是否參與了HNSCC細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)變。細(xì)胞鏡

9、下觀察結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,過表達(dá) DDR2對(duì)細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,同時(shí)免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2對(duì) EMT標(biāo)記性蛋白質(zhì) E-cadherin和vimentin的表達(dá)無明顯改變。在體內(nèi)環(huán)境中,缺氧是觸發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生 EMT轉(zhuǎn)變及轉(zhuǎn)移的一種重要因素,因此我們接下來檢測(cè)了在缺氧環(huán)境下 DDR2是否參與了HNSCC細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)變。細(xì)胞鏡下觀察結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2明顯提高了HNSCC細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)變,免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯

10、示過表達(dá) DDR2組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平明顯降低,同時(shí)伴隨著 vimentin表達(dá)水平的明顯升高。通過上述結(jié)果,我們推測(cè)在 HNSCC細(xì)胞中,DDR2參與 EMT的轉(zhuǎn)變可能部分的需要缺氧因素的介入。
　　DDR2對(duì) HNSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的體外調(diào)控作用在體內(nèi)是否與其一致呢?接下來的實(shí)驗(yàn),我們運(yùn)用裸鼠皮下荷瘤及尾靜脈注瘤肺部轉(zhuǎn)移模型來驗(yàn)證這個(gè)疑問。結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2對(duì)腫瘤瘤體形成及腫瘤生長均無明顯作用。肺是腫瘤細(xì)

11、胞經(jīng)尾靜脈注射后首先接觸的毛細(xì)血管床,因此我們檢測(cè)了DDR2在 HNSCC細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移中的作用。肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)觀察及統(tǒng)計(jì)以及肺組織切片 HE染色結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2明顯促進(jìn)了HNSCC細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程。同時(shí)肺組織轉(zhuǎn)移瘤免疫組化結(jié)果顯示過表達(dá) DDR2顯著提高了MMP2和MMP9的表達(dá)水平。上述結(jié)果提示DDR2在 HNSCC細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述,我們首次發(fā)現(xiàn)了在 HNSCC中,DDR2作為一種促癌基因促進(jìn)了癌