DDR2在腫瘤低氧適應中的作用研究.pdf

1、DDR2（DiscoidinDomainReceptor2）是一種廣泛分布高度保守的受體型酪氨酸激酶，是其配體為天然纖維性膠原（I～III型）。DDR2主要表達于胚胎、腦組織、以及延展性強易增生的組織器官如肝臟、皮膚、連接組織等，目前關于DDR2在腫瘤中表達的確切報道僅限于肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等幾種。由于DDR2的主要功能是促進細胞中MMPs的合成與分泌，因此我們認為腫瘤組織中可能存在這樣的病理過程：腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進程中伴隨著諸如炎癥

2、、低氧等微環(huán)境的異常改變，在這些異常改變的影響下腫瘤細胞中DDR2的表達上調(diào)，同時實體瘤內(nèi)部豐富的間質(zhì)膠原成以及瘤體結構的紊亂為DDR2提供了與其配體相互作用的生理基礎，使DDR2能夠發(fā)生持續(xù)活化，進而通過過分泌MMPs以及其它方式推進腫瘤進程。沿著這條思路，我們對DDR2在腫瘤中的作用進行了初步的研究。
　　我們通過免疫組織化學的方法觀察到，乳腺癌病人的組織標本中，DDR2表達陽性，且明顯高于乳腺組織良性病變標本。定量PCR和免

3、疫印跡方法檢測結果進一步顯示，DDR2的mRNA和蛋白水平在乳腺癌組織中均顯著高于癌旁組織。然而當我們對多個乳腺癌細胞系的DDR2水平檢測后卻發(fā)現(xiàn)，相比腫瘤組織中DDR2的高表達，細胞系中DDR2水平?jīng)]有顯著增高。這種同一分子在細胞系中與組織中表達不相一致的現(xiàn)象提示我們：DDR2表達水平的變化可能與腫瘤微環(huán)境密切相關。
　　ShyuKG等發(fā)現(xiàn)，氧分壓的改變能夠誘導血管平滑肌細胞中DDR2的表達增高。而低氧狀態(tài)是實質(zhì)性腫瘤微環(huán)境基本

4、特征之一，同時也是推動腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的關鍵因素。我們推測，DDR2的水平可能在腫瘤低氧微環(huán)境下應激高調(diào)進而發(fā)揮功能。為了驗證上述推測，我們首先給予包括乳腺癌細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞系低氧及其模擬類似物（CoCl2）刺激，通過檢測發(fā)現(xiàn)低氧刺激可呈時間依賴性上調(diào)腫瘤細胞中DDR2的mRNA和蛋白表達水平，并且這一變化趨勢在上皮細胞中尤為明顯。這表明腫瘤內(nèi)部的低氧環(huán)境可以誘導DDR2表達增高，低氧與DDR2的表達水平之間存在一定的正相

5、關性。由于之前Barker等人就有報道，DDR家族另一成員DDR1在乳腺癌中可見高表達，因此我們在對DDR2與低氧微環(huán)境關系進行研究的同時，也觀察了DDR1在低氧條件下的變化，結果發(fā)現(xiàn)DDR1并不存在這種低氧誘導特性。這也提示DDR家族的兩個成員在腫瘤進程中可能通過完全不同的機制發(fā)揮各自的作用。
　　DDR2作為蛋白酪氨酸激酶受體，發(fā)生磷酸化是其進一步發(fā)揮功能的基礎，因此我們在證實了DDR2表達水平受低氧誘導這一事實的基礎上，想進

6、一步明確DDR2的活性是否也受到低氧的影響。從實驗結果可以得知，DDR2在其天然配體膠原不存在的情況下，低氧前后磷酸化水平未見明顯差異；而當膠原配體存在時，低氧后可見DDR2的磷酸化水平顯著增加，并可保持這種活化狀態(tài)至少48h以上。一方面，這意味著在腫瘤微環(huán)境中，低氧僅能誘導DDR2的表達發(fā)生改變，而與其活化并沒有直接關系。另一方面，這一現(xiàn)象也強烈提示，由于腫瘤間質(zhì)中存在著大量的膠原成分，能夠為低氧條件下高表達的DDR2提供足夠豐富的配

7、體以及與配體相互作用的空間可能，從而使具有慢開慢關且活化強度不高等特性的DDR2在低氧誘導的短時高表達之后能發(fā)生時間更長、相對強度更大的持續(xù)活化效應。
　　在明確了DDR2具有腫瘤低氧誘導特性這一事實后，這種改變所導致的生物學效應及機制就這成為我們下一步關注的焦點。為有利于深入探討DDR2低氧誘導的作用，我們設計了針對DDR2的siRNA，并制備相關慢病毒。目前關于DDR2的研究表明，促進細胞增殖以及MMPs的表達分泌并影響細胞的

8、運動能力是DDR2最主要的功能。MTT結果顯示，常氧狀態(tài)下細胞內(nèi)源DDR2即存在促細胞增殖的作用，低氧條件下DDR2表達水平增高，其促增殖作用更強。此外，在低氧誘導的DDR2影響下，乳腺癌細胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移力顯著增強?；|(zhì)金屬蛋白酶活性分析結果則進一步說明，低氧條件下腫瘤細胞這種依賴于DDR2表達增高而發(fā)生的運動特性改變與促進ECM降解的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2活性增強密切相關。由此可見，DDR2在腫瘤組織低氧微環(huán)境下高表達并持續(xù)活化后

9、，通過介導細胞分泌MMP-2，降解細胞間質(zhì)ECM，以增強細胞運動侵襲能力，進而促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是惡性實體瘤中細胞浸潤轉(zhuǎn)移的一個重要途徑，在多種腫瘤的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中都起著舉足輕重的作用，是上皮細胞惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的基礎。Cannito等人的研究證明，低氧能夠通過誘發(fā)EMT促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化。那么

10、，低氧誘導DDR2并引發(fā)細胞運動能力的改變是否與腫瘤細胞的EMT進程有所關聯(lián)？基于這個疑問，我們通過形態(tài)學觀察和標志性分子檢測等方法分析了低氧條件下腫瘤細胞的改變。結果顯示，乳腺癌細胞MDA-MB-468隨著給予低氧時間的延長，細胞間緊密連接逐漸消失，細胞呈現(xiàn)出明顯的極性特征，上皮細胞分子標志物E-cadherin等的水平降低，伴隨間質(zhì)細胞分子標志物N-cadherin、Vimentin水平增高，細胞發(fā)生EMT改變。而在通過siRNA方

11、法抑制細胞DDR2表達并給予低氧刺激后，細胞EMT改變的形態(tài)學與分子學標志均受到明顯抑制。結合前面關于DDR2能夠促進低氧刺激下細胞運動與侵襲能力增強的實驗結果，我們認為活化的DDR2參與了低氧誘導的細胞EMT改變。
　　通過進一步實驗觀察發(fā)現(xiàn)，這種低氧誘導的EMT過程依賴于DDR2對轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail及鈣粘蛋白E-cadherin的調(diào)控。在對腫瘤細胞進行低氧處理并維持膠原刺激后發(fā)現(xiàn)，維持上皮細胞特性的重要分子E-cadher

12、in的表達受到抑制；而在低氧與膠原刺激的基礎上，對DDR2進行基因沉默后，E-cadherin的表達抑制解除。報告基因檢測結果也顯示，活化型DDR2對E-cadherin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性有顯著的抑制作用，而且這一轉(zhuǎn)錄抑制作用是通過增強轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的活性而完成的。此外，我們的結果還顯示，作為直接參與下調(diào)E-cadherin的最重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail，其表達也與DDR2的水平呈正相關。
　　綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)DDR